HPLC同时测定麦柴方中山麦冬皂苷B和柴胡皂苷A的含量

蔡碧蓉，罗金树

（广东省第二中医院（广东省中医药工程技术研究院），广东 广州 510095）

麦柴方经我院消化内科医师临床验方总结、改进而成，通常用于反流性食管炎和慢性胃炎、胃溃疡患者的治疗、辅助症状控制及恢复[1-2]。该方君药为麦冬、柴胡，臣药为法半夏、郁金，其余丹参、厚朴、蒲公英、黄芩等为佐使药。预实验结果表明，该方疗效显著，安全性较好。由于方中药味较多，成分复杂，有必要对其中成分进行筛选和分析，建立多个指标成分含量同时测定的方法，用以评价该方汤剂的质量，更好地服务临床实践和患者需要。

山麦冬皂苷B 是麦冬中的主要指标性成分，具有抑制结肠癌细胞生长，促进其凋亡的功效；同时该成分对于人胃癌细胞也具有较好的抑制作用，可以作为指标性成分对麦柴方进行基于功效主治的质量评价[3-6]。柴胡中有多个皂苷类成分，其中柴胡皂苷A和柴胡皂苷D研究报道较多，且被现行版《中国药典（2020 年版）》列为含量测定指标；文献报道显示，上述成分能够较好地对肝炎和肝癌起到抑制作用，可能是柴胡疏肝解郁、温中行气的物质基础[7-8]。因此，本文选择上述两种成分为指标，建立含量同时测定方法，进而评价麦柴方的质量。

1 仪器和材料

1.1 仪器 Waters2695e 高效液相色谱仪，配备PDA 检测器和自动进样器，购自美国Waters 公司；Mettler Toledo 电子精密分析天平，购自瑞士Mettler Toledo公司。

1.2 材料和试剂 柴胡皂苷A（批号：110777-201912）、柴胡皂苷D（批号：110778-201912）和山麦冬皂苷B（批号：111907-201804）对照品购自中国食品药品检定研究院（国家标准物质网）；色谱分析和样品制备用乙醇、乙腈、甲酸购自德国Merck 公司，试验用水为Watson 纯净水。麦柴方所用药材购自广州中芝园药业有限公司。

2 实验方法和结果

2.1 对照品溶液制备方法 分别取柴胡皂苷A、柴胡皂苷D 和山麦冬皂苷B 对照品，精密称取约5mL，置于5mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得上述成分含量均为1mg/mL 的对照品溶液。取上述溶液，精密吸取各1mL，转移至10mL量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，即得三者浓度均为100μg/mL的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液制备方法 取处方量药材，加水适量煎煮两次，每次60min，即得麦柴方汤剂。上述汤剂纱布滤过后，浓缩至约200mL，转移至250mL 量瓶中，加水稀释并定容至刻度，即得麦柴方标准汤剂。精密吸取标准汤剂1mL，转移至10mL 量瓶中，加乙醇稀释并定容至刻度。所得溶液滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 含量测定方法 吸取混合对照品和供试品溶液，所用色谱柱为Waters Xbridge C18（规格为长25cm，内径0.46cm，填料粒径5μm），流动相为0.2%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脱程序为：0～5min，5%-5%B；5～10min，5%-25%B；10～20min，25%-75%B；20～25min，75%-5%B；25～30min，5%-5%B，后运行时间5min；流速1.0mL/min，检测波长210nm，柱温30℃，进样量10μL。记录所得对照品和供试品色谱图，见图1。

图1 HPLC测定麦柴方对照品和供试品溶液图谱

2.4 方法学考察

2.4.1 标准曲线和线性 取山麦冬皂苷B和柴胡皂苷A 对照品溶液，分别精密吸取适量，转移至多个5mL 量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，即得上述两种成分含量均分别为5、10、20、50、100、200μg/mL的混合对照品溶液。吸取上述溶液，注入HPLC 中，使用“2.3”项下所述方法分析测定，记录各组样品中山麦冬皂苷B和柴胡皂苷A的峰面积，以峰面积为纵坐标y，对应浓度为横坐标x，使用excel 软件进行线性回归。计算得山麦冬皂苷B的回归方程为y=46355x+44136（r=0.99985），柴胡皂苷A 的归回方程为y=21197x-2979.5（r=0.99975）。上述结果表明，方法线性良好，能够在5～200μg/mL 的浓度范围内对山麦冬皂苷B 和柴胡皂苷A进行准确测定。

2.4.2 精密度考察 吸取供试品溶液，注入HPLC中，使用“2.3”项下所述方法分析测定，重复测定6次，记录各组样品中山麦冬皂苷B 和柴胡皂苷A的峰面积，分别计算二者峰面积的RSD。计算得山麦冬皂苷B 和柴胡皂苷A 峰面积的RSD 分别为1.14%和0.86%，经对比现行版《中国药典》相关规定，上述结果均符合要求，即方法的精密度良好。

2.4.3 重复性考察 按“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，吸取上述溶液，注入HPLC 中，使用“2.3”项下所述方法分析测定，记录各组样品中山麦冬皂苷B 和柴胡皂苷A 的峰面积，分别计算二者的含量和含量的RSD；计算得山麦冬皂苷B和柴胡皂苷A 含量的RSD 分别为0.65% 和0.29%，经对比现行版《中国药典》相关规定，上述结果均符合要求，即方法的精密度良好。

2.4.4 稳定性考察 取供试品溶液，置于自动进样器中，分别于放置后0、2、4、6、8、12 小时注入HPLC中，使用“2.3”项下所述方法分析测定，记录各组样品中山麦冬皂苷B 和柴胡皂苷A 的峰面积，分别计算二者的含量和含量的RSD；计算得山麦冬皂苷B 和柴胡皂苷A 含量的RSD 分别为1.59%和0.98%，经对比现行版《中国药典》相关规定，上述结果均符合要求，即方法所制备样品在12h内稳定性良好。

2.4.5 加样回收率测定 精密吸取“2.2”项下所制备的麦柴方标准汤剂0.5mL，转移至10mL 量瓶中，按表1、表2 所述最终浓度加入山麦冬皂苷B和柴胡皂苷A 对照品溶液适量，分别配制成低、中、高三个添加浓度的供试品溶液。吸取上述溶液，注入HPLC 中，使用“2.3”项下所述方法分析测定，记录各组样品中山麦冬皂苷B 和柴胡皂苷A的峰面积，分别计算二者的含量、回收率和回收率的RSD。计算得山麦冬皂苷B 和柴胡皂苷A的平均回收率分别为100.31%和99.91%，对应RSD 分别为2.84%和3.32%，经对比现行版《中国药典》相关规定，上述结果均符合要求，即方法准确度良好。

表1 山麦冬皂苷B加样回收率测定结果（n=3）

表2 山麦冬皂苷B加样回收率测定结果（n=3）

2.5 样品测定 取处方量药材，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，共平行制备10 份，吸取上述溶液，注入HPLC 中，使用“2.3”项下所述方法分析测定，记录各组样品中山麦冬皂苷B 和柴胡皂苷A 的峰面积，分别计算二者的含量。计算得10 批供试品测定结果为，山麦冬皂苷B 含量0.6545～0.7721mg/mL，柴胡皂苷A 含量0.2095～0.3440mg/mL，见表3。

表3 10批样品含量测定结果（n=2）

3 讨论

笔者在预实验中发现，供试品色谱图中并未指认出明显的柴胡皂苷D 色谱峰，但该成分对照品峰较为明显，故基本排除检测方法的问题。经分析和验证，产生上述结果可能是由于使用纯水煎煮药材时，无法有效提取柴胡皂苷D，即麦柴方汤剂中并不含此类成分。综合考虑实验结果和临床使用情况，选择不将柴胡皂苷D 列为含量测定的指标成分。

色谱条件优化和文献调研结果显示，山麦冬皂苷B 和柴胡皂苷A 出峰时间差异较大，两峰附近无干扰峰出现，因此本文“2.3”项下色谱条件能够成功分离二者。影响测定较为明显的因素为供试品制备方法。预实验对提取方式（直接使用乙醇溶解，乙酸乙酯提取后乙醇复溶）、溶剂用量（1:5、1:10、1:20）进行了考察，结果显示乙酸乙酯萃取法提取效率较低，且由于萃取操作较为繁琐，因此重复性和准确度无法保证；溶剂用量考察方面，当溶剂和标准汤剂比例为1:5、1:10 时，前者各指标成分含量均较后者为低（结果略），而当比例变为1:20 时，所得结果较1:10 并无明显变化，表明“2.2”项下所述方法已能够较为充分提取。