miR-214对奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能的影响

刘杰, 魏祥飞, 曲波, 王春梅, 姜毓君, 张莉

（东北农业大学乳品科学教育部重点实验室, 哈尔滨 150030）

0 引言

MicroRNA是一类能够参与基因表达、细胞周期、疾病发生等生物过程的短链非编码RNA分子, 广泛存在于动植物体内[1]。MicroRNA在不同的生理条件下通过与靶基因mRNA的3’UTR互补配对, 从而抑制基因的表达, 调控细胞生理过程[2]。在奶牛乳腺中, microRNA被发现具有重要的调节作用, 其已经被发现参与乳腺发育、泌乳周期发展、乳成分合成等过程[3-5]。此外, 研究发现在不同健康状态的奶牛乳腺中microRNA的表达不同, 这被认为可能是奶牛健康状态的潜在标志[6-7]。MiR-214定位于奶牛的第16条染色体, 其对骨骼发育、细胞凋亡、免疫调节等蛋白表达的作用已经有相关报道[8-10]。Sang等[11-13]发现miR-214可以激活AKT/mTOR信号通路, 而该通路的激活是乳成分合成过程中的关键, 表明miR-214有可能会影响泌乳过程。但是, miR-214是否可以影响奶牛泌乳还没有研究报道。在前期的实验中我们发现miR-214在高产和低产奶牛的乳腺组织中的表达存在显著差异, 高产奶牛乳腺组织中miR-214的表达较低, 而低产奶牛乳腺组织中miR-214处于高表达状态。为了探究miR-214对奶牛泌乳的影响, 本实验通过构建奶牛乳腺上皮细胞模型, 在奶牛乳腺上皮细胞中超表达miR-214, 研究miR-214对奶牛泌乳功能的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

胶原酶IV, sigma；胎牛血清, BI；DF12培养液干粉、胰 酶, Giboc；Lipofectamine 3000, Thermo Fisher Scientific；HiPure Total RNA Micro Kit, Magen；Prime－Script试剂盒、SYBR Premix Ex Taq试剂盒, TaKaRa；细胞裂解液, Beyotime Biotechnology；酪蛋白一抗、CCK18一 抗, Abcam；Bovine Lactose ELISA KIT, Ruifan biological；组织细胞甘油三脂酶法测定试剂盒, PPLYGEN。

1.2 奶牛乳腺上皮细胞的获取与鉴定

本实验所用的奶牛乳腺上皮细胞（BMECs）是通过酶消化法从奶牛乳腺组织中分离得到, 细胞沉淀使用含10%血清, 100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DF12培养液悬浮, 并处于5% CO2、37℃无菌环境中培养, 培养2～5 d。当细胞铺满培养瓶底后, 使用0.25%胰酶纯化, 并采用免疫荧光法对细胞进行CCK18鉴定, 使用FITC标记的荧光二抗标记角蛋白18, 用DAPI标记细胞核。

1.3 奶牛乳腺上皮细胞中miR-214的过表达

细胞悬液以1×107/孔的比例均匀的接种至6孔板中培养, 细胞密度达到80%左右时使用5μL Lipofectamine 3 000将5μL miRNA瞬时转染至乳腺上皮细胞内, 培养48 h检测。实验分组：空白组、NC组（100 nmol/L miR-9-5p NC）、miR-214过表达组（100 nmol/L miR-9-5p mimics）。

1.4 荧光定量PCR检测miR-214的表达

使用HiPure Total RNA Micro Kit提取总RNA, 并根据RNA的紫外光谱特性(Thermo Fisher Scientific)评价其质量。每一个RNA样品通过PrimeScript试剂盒逆转录成cDNA, 用SYBR Premix Ex Taq试剂盒和7300 Real-time PCR体系扩增miR-214, 重复3次。引物如表1所示。

表1 荧光定量PCR引物序列

1.5 细胞酪蛋白表达量的检测

使用100μL细胞裂解液收集处理的细胞, 总蛋白浓度通过BCA方法检测。等量蛋白质被10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离后在0.22μm NC膜上印迹。在含有5%脱脂乳的TBS/T缓冲液中37℃孵育2 h, 将膜放入稀释的酪蛋白一抗中4℃孵育过夜, 经TBS/T缓冲液洗涤后, 与含HRP标记的抗兔IgG（Abcam）37℃孵育1 h。经洗涤后的膜采用增强化学发光检测系统(Cell Signaling Technology)检测蛋白带, 结果使用Image-Pro Plus 6.0软件进行分析。

1.6 细胞乳糖分泌量的检测

使用Bovine Lactose ELISA KIT检测乳糖含量。处理后的细胞收集上清培养液3 000 rpm离心10 min去除颗粒和聚合物, 取上清液, 根据制造商说明书在450 nm波长下测量吸光度值, 按照标准品曲线方程计算浓度。

1.7 细胞乳脂分泌量的检测

使用组织细胞甘油三脂酶法测定试剂盒检测乳脂含量。处理后的细胞使用100μL裂解液收集, 裂解液70℃处理10 min后室温2 000 rpm离心5 min。取上清液按照制造商说明书操作, 最后在550 nm波长下测量吸光度值, 按照标准品曲线方程计算乳脂浓度。

1.8 数据处理与统计分析

GraphPad Prim 8被用来对所有数据进行统计分析, 每组数据用平均数±标准差表示, 组间比较采用单因素方差分析, 组内比较采用t检验。P＜0.05表示具有统计学差异, P＜0.01表示具有统计学极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 奶牛乳腺上皮细胞的分离培养与鉴定结果

图1中为奶牛乳腺上皮细胞在纯化前后的形态, 在倒置显微镜下奶牛乳腺上皮细胞呈现椭圆形紧密排列。结果如图1, 纯化前, 细胞从乳腺组织块中慢慢爬出, 其中含有大量呈长梭形、放射状的成纤维细胞。纯化后, 绝大多数是均匀排列的奶牛乳腺上皮细胞。将纯化后的细胞经CCK18鉴定, 如图2所示, 细胞核（蓝色）周围有大量的CCK18（绿色）, 这表明纯化得到的细胞主要为奶牛乳腺上皮细胞。

图1 奶牛乳腺上皮细胞的培养与纯化

图2 奶牛乳腺上皮细胞角蛋白18的鉴定

2.2 奶牛乳腺上皮细胞中miR-214的过表达检测

在奶牛乳腺上皮细胞中过表达miR-214, 荧光定量检测miR-214的表达量。结果如图3所示, 与空白组和NC组相比, 过表达miR-214的奶牛乳腺上皮细胞中miR-214的表达量显著性升高（P＜0.01）。

图3 奶牛乳腺上皮细胞中miR-214的过表达检测

2.3 miR-214对奶牛乳腺上皮细胞中酪蛋白合成的影响

酪蛋白是主要的乳蛋白成分。为检测miR-214对乳蛋白合成的影响, 过表达miR-214后, 使用western blotting检测细胞中酪蛋白的含量。结果如图4所示, 与空白组和NC组相比, 过表达miR-214的奶牛乳腺上皮细胞中酪蛋白的表达量显著下降（P＜0.01）, 表明miR-214可以抑制乳腺上皮细胞中乳蛋白的合成。

图4 MiR-214对奶牛乳腺上皮细胞中酪蛋白合成的影响

2.4 miR-214对奶牛乳腺上皮细胞中乳糖合成的影响

在BMECs中过表达miR-214后, 收集48 h细胞上清培养液, 检测乳糖含量。根据Bovine Lactose ELISA KIT绘制乳糖标准曲线, 并对照标准曲线方程计算样品中乳糖的含量。结果如图5所示, 与空白组和NC组相比, 过表达miR-214引起乳腺上皮细胞内的乳糖含量显著降低（P＜0.05）, 降至34.09μg/mL。实验结果表明miR-214可以抑制奶牛乳腺上皮细胞中乳糖的合成。

图5 MiR-214对奶牛乳腺上皮细胞中乳糖合成的影响

2.5 miR-214对奶牛乳腺上皮细胞中乳脂合成的影响

在BMECs中过表达miR-214后, 使用裂解液收集细胞检测乳脂的含量。根据组织细胞甘油三脂酶法测定试剂盒绘制标准曲线, 并根据标准曲线计算样品中乳脂的含量。结果如图6所示, 与空白组和NC组相比, 过表达miR-214引起奶牛乳腺上皮细胞内乳脂含量显著降低（P＜0.01）, 降至113.62μmol/L。实验结果表明miR-214可以抑制奶牛乳腺上皮细胞中乳脂的合成。

图6 MiR-214对奶牛乳腺上皮细胞中乳脂合成的影响

3 讨 论

乳腺上皮细胞是乳腺组织在泌乳过程中主要的分泌细胞, 其分泌的乳成分主要有乳糖、乳脂和乳蛋白[14-15]。乳糖是由转运入细胞内的葡萄糖合成而来, 一方面是乳汁中主要成分, 同时还是维持细胞内渗透压的主要物质, 与奶牛泌乳量密切相关[16-17]。乳蛋白中有80%是酪蛋白, 其是乳汁中特有的一种磷蛋白, 可以通过检测酪蛋白的表达量来判断奶牛乳腺上皮细胞的乳蛋白合成能力[18]。在乳成分的合成中主要包括细胞内合成和血液中吸收营养物质两个过程, 需要多种因素的共同调节, 包括激素、细胞因子以及相关信号通路的激活等[19-21]。近年来, microRNA作为基因表达调节的关键因子被相继报道。已有研究表明, microRNA参与了奶牛乳腺的凋亡、发育、乳汁合成以及疾病的发生等过程[22-23]。Li等[24]研究发现miR-486可以靶向调控PTEN基因的表达从而调节下游基因的表达进而影响泌乳的过程。有研究也发现在奶牛泌乳期时miR-486通过LATS2参与乳脂的合成[3]。此外, microRNA还参与奶牛乳腺组织中的表观遗传修饰过程。Bian等[25]发现miR-29s可以通过调节DNMT3a的表达, 改变奶牛乳腺中基因的DNA甲基化状态从而引起基因差异表达, 其中包括CSN2、GLUT1、SREBP1等。

MiR-214以高度保守的状态存在于多个物种。有研究表明, miR-214通过靶向调节Pten, 作用于PI3K/AKT信号通路增加骨质活性, 促进牛的骨质疏松[8]。本实验室在前期的工作中发现miR-214在高、低产奶牛乳腺中表达差异显著。本研究进一步探索了miR-214在奶牛乳腺中的作用, 发现过表达miR-214后奶牛乳腺上皮细胞的乳糖、乳脂和乳蛋白的合成能力显著降低, 这些结果表明了miR-214参与了奶牛的泌乳调节, 相关的具体作用机制还有待进一步研究。总之, 我们的研究初步探讨了miR-214对奶牛泌乳的影响, 为进一步了解泌乳机制、提高乳品质进行泌乳调控研究提供了新的思路和作用靶点。

4 结论

本研究表明, miR-214在奶牛乳腺上皮细胞中负调控泌乳过程, miR-214过表达降低了酪蛋白的表达, 同时抑制甘油三脂和乳糖的合成, 表明miR-214对奶牛乳腺上皮细胞的乳糖、乳脂和乳蛋白合成具有抑制作用, 并且可能通过调节miR-214的表达影响奶牛泌乳。