32个百合品种遗传多样性分析和DNA指纹图谱构建

王子康，苏江硕，张雪峰，宁心怡，周迎雪，房伟民，陈发棣，张 飞

(南京农业大学园艺学院，江苏 南京 210095)

百合(Liliumspp.)是百合科(Liliaceae)百合属(LiliumLinn.)植物的统称，品种繁多，目前全世界的百合品种多达10 000余个[1]。中国观赏百合的商品化栽培较晚，自主研发的品种较少，大部分观赏百合的商品种球均依赖进口[2]，但很多进口品种存在“同物异名”的问题，亟待进一步鉴定。此外，不同百合品种表型变异丰富、遗传背景复杂，了解不同百合品种间的遗传距离及不同杂种系间的亲缘关系对指导中国观赏百合新品种的选育有重要意义[3]。

DNA指纹图谱技术是基于DNA分子标记建立的能够进行品种纯度及真实性检测的一种现代手段。比起通过植物外部表型来鉴定品种，DNA指纹图谱具有不受环境因子影响、方便、可靠和快速等优点[4]。目前，DNA指纹图谱技术已广泛用于睡莲(NymphaeatetragonaGeorgi.)[5]、钝叶杜鹃〔Rhododendronobtusum(Lindl.)Planch.〕[6]和春兰〔Cymbidiumgoeringii(Rchb.f.)Rchb.F.〕[7]、丛生竹杂交种[8]和杨柳科(Salicaceae)植物[9]等种质资源的鉴定，还用于药用百合种质资源的品种鉴定[10]，但在观赏百合上鲜有相关报道[11]。

相关序列扩增多态性(SRAP)标记作为分子标记的一种方法，除了其引物没有物种特异性外，还具有操作简单、稳定、成本低和高共显性等优点[12]。目前，SRAP分子标记已被广泛应用于植物的遗传多样性评价、亲缘关系分析和指纹图谱构建等方面[13，14]。然而，目前国内外相关学者基于SRAP标记对百合种质资源的研究主要在其遗传多样性和亲缘关系上[15-17]，尚无观赏百合品种资源DNA指纹图谱构建的相关报道。鉴于此，本研究利用SRAP分子标记分析了来自4个不同杂种系的32个观赏百合品种的遗传多样性和亲缘关系，并构建了DNA指纹图谱，旨在为百合品种资源鉴定和杂交亲本选择提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试百合种球购自江苏省沭阳县新河镇左猛种子经营部和虹越花卉股份有限公司，均为进口的观赏百合品种。供试32个百合品种来自4个杂种系，包括‘Tiny Moon’、‘Tiny Rocket’、‘Tiny Padhye’、‘Tiny Bee’、‘Tiny Ghost’和‘Yellow Pearl’6个亚洲百合(LiliumAsiatica Hybrids)杂种系(A)的品种；‘Sweet Valley’、‘Dynamix’、‘Mingo Orange’、‘Summer Sky’、‘Summer Snow’、‘Sweet Sugar’、‘Eyeliner’、‘Acumen’和‘Mistery Dream’9个铁炮百合(LiliumlongiflorumThunb.)与亚洲百合杂种系(LA)的品种；‘Siberia’、‘Sorbone’、‘Sunny Azores’、‘After Eight’、‘Sunny Martinique’、‘Lotus Wonder’、‘Lsabella’、‘Snowboard’、‘Monica’和‘Aisha’10个东方百合(LiliumOriental Hybrids)杂种系(O)的品种；‘White Eyes’、‘Exotic Sun’、‘Conca D’or’、‘Palazzo’、‘Zambesi’、‘Robina’和‘Friso’7个东方百合与喇叭百合(LiliumTrumpet Hybrids)杂种系(OT)的品种。于2021年9月将32个百合品种栽植于南京农业大学湖熟花卉基地；同年10月，采集处于旺盛营养生长期的植株顶端的嫩叶，每个品种采5～8株，每株采集3～5枚叶片，用锡箔纸包好后放入液氮中冷冻，置于-80 ℃冰箱保存、备用。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 参考文献[18]，采用改良的CTAB法提取百合基因组DNA。利用NanoDrop One超微量分光光度计〔赛默飞世尔科技(中国)有限公司〕检测DNA的浓度和纯度，然后将其稀释到100 ng·μL-1，置于-20 ℃冰箱保存、备用。

1.2.2 SRAP-PCR反应程序及电泳检测 SRAP-PCR体系总体积为20.0 μL，包括10×PCR Buffer 2.0 μL、2.5 nmol·μL-1dNTPs 1.8 μL、10 nmol·μL-1正向和反向引物各1.0 μL、5 U·μL-1TaqDNA聚合酶0.2 μL、100 ng·μL-1模板DNA 1.0 μL和ddH2O 13.0 μL。所用试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min、35 ℃复性1 min、72 ℃延伸1 min，共5个循环；94 ℃变性1 min、50 ℃复性1 min、72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物于4 ℃保存、备用。

PCR扩增结束后，用质量体积分数8%非变性聚丙稀酰胺凝胶(PAGE)进行电泳分离，介质为1×TBE缓冲液，PCR扩增产物加样量为5.0 μL，点样结束后在240 V恒压下电泳90 min。电泳结束后用银染法[18]染色，并对所得电泳胶图拍照记录。

1.2.3 引物筛选 SRAP正向和反向引物序列来源于Li等[19]，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。基于前人在百合研究中筛选得到的53对多态性良好的SRAP引物[15-17]，本研究进一步筛选得到17对引物。

1.3 数据处理和分析

本试验仅对扩增条带清晰的多态性位点进行统计。在相同迁移位置上，有条带的记为“1”，没有条带或条带不明显的记为“0”；品种条带缺失的记为NA(在后续的软件分析中，根据不同软件对录入数据的要求转换成相应的记录形式)。标记条带的命名方法为“引物对-扩增片段大小”，如“ME11-EM8-110”表示引物ME11-EM8在电泳图谱上DNA大小为110 bp处扩增出的多态性条带。依此方法得到每对引物的“0”“1”数据矩阵，利用EXCEL 2016软件记录，并统计多态性条带数。根据数理统计原理，2个品种的指纹图谱完全相同的概率(P)的计算公式为P=1/2n,式中，n表示该SRAP引物扩增出的多态性条带数[20]。

利用Quantity One软件计算多态性位点的大小。利用POWERMARKER Ver.3.25软件计算Nei’s基因多样性指数和多态性信息含量指数，利用NTSYS pc Ver.2.10e软件计算不同品种间的遗传相似系数，并采用UPGMA方法进行聚类分析。

2 结果和分析

2.1 SRAP标记多态性分析

结果(表1)显示：筛选得到的17对多态性引物，共扩增出177个清晰的多态性条带。17对引物扩增出的多态性条带数在5～18之间，引物ME11-EM8扩增出的多态性条带数最多，引物ME7-EM5扩增出的多态性条带数最少，平均每对引物扩增出的多态性条带数为10.4。17对引物的Nei’s基因多样性指数在0.366 8～0.475 6之间，平均Nei’s基因多样性指数为0.424 9，引物ME10-EM3的Nei’s基因多样性指数最高，引物ME12-EM1的Nei’s基因多样性指数最低。17对引物的多态性信息含量指数(PIC)在0.286 4～0.362 3之间，平均PIC值为0.330 6，引物ME10-EM3的PIC值最高，引物ME12-EM1的PIC值最低。

表1 17对多态性SRAP引物的扩增结果

2.2 遗传相似系数和聚类分析

基于SRAP数据分析得到32个百合品种的遗传相似系数(表2)。结果显示：不同百合品种间的遗传相似系数(GS)为0.356～0.836，平均值为0.561，其中，‘Tiny Bee’与‘Sunny Azores’间的GS值最小,‘Palazzo’与‘Robina’间的GS值最大。6个亚洲百合杂种系(A)品种间的GS值为0.554～0.735，平均值为0.638；9个铁炮百合与亚洲百合杂种系(LA)品种间的GS值为0.608～0.753，平均值为0.674；10个东方百合杂种系(O)品种间的GS值为0.593～0.808，平均值为0.709；7个东方百合与喇叭百合杂种系(OT)品种间的GS值为0.545～0.836，平均值为0.675。

表2 32个百合品种的遗传相似系数1)

聚类分析结果(图1)显示：在GS值为0.578处，32个百合品种可分为2个类群：类群Ⅰ包含15个品种，均属于A和LA百合杂种系；类群Ⅱ包含17个品种，均属于O和OT百合杂种系。在GS值为0.632处，类群Ⅰ可进一步分为3个亚类群，类群Ⅱ可进一步分为2个亚类群：亚类群Ⅰa包含‘Tiny Moon’、‘Tiny Rocket’、‘Yellow Pearl’和‘Tiny Ghost’4个品种，均属于A百合杂种系；亚类群Ⅰb包含‘Sweet Valley’、‘Mingo Orange’、‘Summer Snow’、‘Sweet Sugar’、‘Eyeliner’、‘Dynamix’、‘Acumen’、‘Mistery Dream’和‘Summer Sky’9个品种，均属于LA百合杂种系；亚类群Ⅰc包含‘Tiny Padhye’和‘Tiny Bee’2个品种，均属于A百合杂种系；亚类群Ⅱa包含‘Sorbone’、‘Siberia’、‘Sunny Azores’、‘After Eight’、‘Sunny Martinique’、‘Lotus Wonder’、‘Snowboard’、‘White Eyes’、‘Monica’、‘Aisha’、‘Lsabella’、‘Palazzo’、‘Robina’、‘Exotic Sun’、‘Conca D’or’、‘Zambesi’16个品种，属于O和OT百合杂种系；亚类群Ⅱb仅包含‘Friso’1个品种，属于OT百合杂种系。

图1 基于SRAP标记的32个百合品种的UPGMA聚类图

2.3 指纹图谱构建

在筛选出的17对多态性引物中，引物ME11-EM8可将32个百合品种完全区分开，其对32个百合品种DNA的扩增结果见图2。结果显示：基于引物ME11-EM8扩增出的32个百合品种的DNA扩增条带清晰，可用于指纹图谱构建。

M: DL2000 DNA marker.1：‘Tiny Moon’；2：‘Tiny Rocket’；3：‘Tiny Padhye’；4：‘Tiny Bee’；5：‘Tiny Ghost’；6：‘Yellow Pearl’；7：‘Sweet Valley’；8：‘Dynamix’；9：‘Mingo Orange’；10：‘Summer Sky’；11：‘Summer Snow’；12：‘Sweet Sugar’；13：‘Eyeliner’；14：‘Acumen’；15：‘Mistery Dream’；16：‘Siberia’；17：‘Sorbone’；18：‘Sunny Azores’；19：‘After Eight’；20：‘Sunny Martinique’；21：‘Lotus Wonder’；22：‘Lsabella’；23：‘Snowboard’；24：‘Monica’；25：‘Aisha’；26：‘White Eyes’；27：‘Exotic Sun’；28：‘Conca D’or’；29：‘Palazzo’；30：‘Zambesi’；31：‘Robina’；32：‘Friso’.

选择引物ME11-EM8扩增出的18个清晰明显的多态性条带构建32个百合品种的DNA指纹图谱，多态性条带的DNA片段长度分别为75、110、126、146、158、170、176、187、197、216、217、238、257、277、293、304、359和410 bp，结果见图3。统计结果显示：引物ME11-EM8扩增出18个多态性条带，则出现2个品种的指纹图谱完全相同的概率为P=1/218，指纹图谱的置信概率高达99.99%。

1：‘Tiny Moon’；2：‘Tiny Rocket’；3：‘Tiny Padhye’；4：‘Tiny Bee’；5：‘Tiny Ghost’；6：‘Yellow Pearl’；7：‘Sweet Valley’；8：‘Dynamix’；9：‘Mingo Orange’；10：‘Summer Sky’；11：‘Summer Snow’；12：‘Sweet Sugar’；13：‘Eyeliner’；14：‘Acumen’；15：‘Mistery Dream’；16：‘Siberia’；17：‘Sorbone’；18：‘Sunny Azores’；19：‘After Eight’；20：‘Sunny Martinique’；21：‘Lotus Wonder’；22：‘Lsabella’；23：‘Snowboard’；24：‘Monica’；25：‘Aisha’；26：‘White Eyes’；27：‘Exotic Sun’；28：‘Conca D’or’；29：‘Palazzo’；30：‘Zambesi’；31：‘Robina’；32：‘Friso’.

3 讨论和结论

品种鉴定在植物育种和农业生产等方面具有重要意义，是保护植物品种权、防止假冒劣质品种进入市场的重要手段[21,22]。常用的品种鉴定方法有形态学鉴定、细胞学鉴定、生理生化鉴定和分子标记鉴定[23]。其中，分子标记鉴定法从DNA水平揭示了基因组结构和排列的特点及碱基序列差异，检测位点数量多，稳定性和可靠性较好[24]。本研究筛选到的17对多态性SRAP引物共扩增出177个多态性条带，平均每对引物扩增10.4个多态性条带，平均多态性条带数多于石斛兰(DendrobiumnobileLindl.)[25]和孤挺花(HippeastrumhybridumHort.)[26]等花卉。17对引物的平均多态性信息含量指数(PIC)为0.330 6，且每对引物的PIC值均大于0.25，根据Botstein等[27]提出的度量基因座位变异程度的多态性信息含量标准(当0.25

百合品种资源丰富，遗传背景复杂。本研究中，32个百合品种间的遗传相似系数(GS)为0.356～0.836，平均值为0.561，说明这些进口的观赏百合品种在DNA水平上存在丰富的遗传多样性。在32个百合品种中，同一杂种系的品种间的GS最小值均大于0.54，说明同一杂种系的百合品种具有更近的亲缘关系，遗传背景可能更加相似。聚类分析结果显示：在GS值为0.578处，32个百合品种可分为2个类群，其中，亚洲百合杂种系(A)和铁炮百合与亚洲百合杂种系(LA)的品种聚为类群Ⅰ，东方百合杂种系(O)和东方百合与喇叭百合杂种系(OT)的品种聚为类群Ⅱ，聚类结果与百合的杂交育种史相吻合，也与Cui等[28]和肖伟等[3]基于ISSR标记研究的不同百合杂种系间的遗传关系的结果一致。进一步分析发现，在GS值为0.632处，类群Ⅱ可进一步被分为2个亚类群，其中，亚类群Ⅱb仅包含‘Friso’1个品种，说明‘Friso’与其他供试的O和OT百合杂种系品种间的亲缘关系较远，在未来百合新品种的选育中，其可作为特殊的亲本材料以增加新品种间的遗传差异。

DNA指纹图谱构建的原则是用尽可能少的引物区分尽可能多的品种[29]。在本研究筛选到的17对多态性引物中，引物ME11-EM8可将32个百合品种完全区分开，基于其扩增出的18个多态性条带构建了32个百合品种的DNA指纹图谱，指纹图谱的置信概率高达99.99%，说明构建的DNA指纹图谱在鉴定百合品种上具有很好的准确性。当然，随着百合品种数量的增加，需要不断选择和增加核心引物，适时扩充百合品种的指纹图谱数据库，以保证指纹图谱数据的准确性和可靠性。

综上所述，引物ME11-EM8可将32个百合品种完全区分开，依据其构建的DNA指纹图谱在鉴定百合品种上具有很好的准确性，可用于百合品种资源的鉴定；在未来百合新品种的选育中，‘Friso’可作为特殊的亲本材料以增加新品种间的遗传差异。