王擎实,任 宏*,王 华,蒙锦莹,李高峰
(1 西安交通大学第一附属医院胸外科,西安 710000;2 咸阳市第一人民医院肿瘤科;3 昆明医科大学第三附属医院胸外科;* 通讯作者,E-mail:1489647081@qq.com)
最新流行病学数据显示,肺癌占所有癌症的26%~29%,其中非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)约占所有肺癌的80%[1]。研究发现微小RNA(microRNA,miRNA)与NSCLC的化疗、放疗抵抗及表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKI)耐药密切[2],miRNA是链较短的一系列内源性RNA,虽然不具备编码能力,但是可靶向结合信使RNA,即靶向3′端非翻译区域并降解RNA。miR-375和miR-92b均是近年来发现与NSCLC有关的微小RNA,miR-375、miR-92b过表达与NSCLC预后和病情有关[3,4]。同时miR-375和miR-92b能靶向调控肿瘤相关因子的活性,如可靶向调控Nemo样激酶(nemo-like kinase,NLK),NLK作为ERK/MAPK以及CDK家族的一员,是一种特异性的苏氨酸/丝氨酸激酶[5,6]。NLK与多种肿瘤的发生发展相关,包括皮肤鳞状细胞癌[7]、宫颈鳞癌[8]、结直肠癌[9]等,其中NLK表达与NSCLC临床分期呈负相关,且过表达NLK可抑制NSCLC细胞增殖[10]。miRNA能与NLK相互作用并调节NLK活性[11],但miR-375、miR-92b调控网络是否可靶向NLK对NSCLC细胞生物学行为及与上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)产生影响,这仍未见报道,鉴于此,本次研究通过观察非小细胞肺癌A549细胞中miR-375、miR-92b和NLK关系,探讨miR-375、miR-92b靶向NLK对非小细胞肺癌细胞生物学功能及上皮间质转化的影响。
人NSCLC细胞系A549细胞,由中国科学院上海分部细胞库提供(货号为20211004)。miR-375、miR-92b的类似物(mimic)、抑制剂(inhibitor)及相应阴性对照(negative control)对照厂商为上海吉玛制药技术有限公司;抗NLK、抗miR-375、抗miR-92b、EMT标记蛋白(抗E-cadhein、抗vimentin)厂商均为美国细胞信号技术(CST)公司;LipofectamineTM2000厂商为美国Invitrogen公司;pMIR-REPORT双荧光素酶试剂盒和1000 Assay System检测系统厂商为美国Thermo Fisher公司。
1.2.1 细胞培养及分组处理 采用DMEM培养基将A549细胞置于培养箱中培养,步骤严格按照说明操作,待A549细胞融合至80%左右时,用胰酶消化、传代培养。将对数生长期A549细胞(5×105个/孔)接种于96孔板,并分为7组:正常对照组、miR-375阴性对照组、miR-92b阴性对照组、miR-375+miR92b阴性对照组、miR-375抑制组、miR-92b抑制组和miR-375+miR-92b抑制组。按照LipofectamineTM2000说明书要求行转染实验:正常对照组A549细胞不进行转染,miR-375阴性对照组、miR-92b阴性对照组、miR-375+miR92b阴性对照组A549细胞分别转染miR-375 negative control、miR-92b negative control和miR-375 negative control+miR-92b negative control,miR-375抑制组、miR-92b抑制组和miR-375+miR-92b抑制组A549细胞分别转染miR-375 inhibitor、miR-92b inhibitor和miR-375 inhibitor+miR-92b inhibitor。
1.2.2 基因实验验证A549细胞中miR-375、miR-92b与NLK之间的靶向关系 利用工具网站Starbase预测miR-375、miR-92b与NLK之间的靶向关系及结合位点。构建NLK的野生型(NLK-WT)和突变型(NLK-MUT)3′非翻译区(untranslated region,UTR)-荧光素酶表达载体,采用脂质体转染技术将miR-92b阴性对照(或miR-375阴性对照)共转入A549细胞中,命名为miR-92b Con组(或miR-375 Con组),同时NLK-WT或NLK-MUT 3′UTR-荧光素酶表达载体也与miR-92b类似物或miR-375类似物也共转入A549细胞中,命名为miR-92b组或miR-375组。使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒测定萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性,以两者比值作为荧光素酶的相对活性。
1.2.3 qRT-PCR法检测NLK mRNA表达水平 各组细胞转染后24 h,离心收集上清,加入0.2倍上清液体积的外泌体纯化试剂,混匀,4 ℃静置孵育12 h,离心去上清,收集外泌体沉淀,加入PBS缓冲液100 μl重悬。分别培养72 h时,使用Trizol试剂提取各组总RNA,逆转录合成cRNA,按照qRT-PCR试剂盒说明书,在荧光定量PCR仪上检测NLK表达。NLK引物序列,上游:5′-GGATGTGCATTCTATGGTGTACC-3′;下游:5′-TTTCGGGATTGCTTATCTCAGAC-3′。GADPH引物序列,上游:5′-AGATTGTGTGATGAAGGACATGG-3′;下游:5′-TGTTGCTGGTGAGTGTGCATT-3′。以2-ΔΔCt法表示,以GADPH为内参基因。反应条件:95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,60 ℃延伸5 min循环40次。
1.2.4 CCK-8法检测细胞增殖 取转染后各组细胞1×104个(100 μl)接种于96孔板,培养72 h时添加CCK-8溶液(10 μl),37 ℃条件下继续培养2 h,酶标仪测量吸光度(OD450 nm)。
1.2.5 划痕实验法检测细胞迁移 取转染后继续培养的7组细胞1×104个(100 μl)接种于96孔板,当孔中细胞达到约90%覆盖度时,用200 μl的移液器吸头在孔板正中做划痕。在相同条件下继续培养72 h后,采用光学显微镜观察细胞的图像并拍照,迁移距离为细胞越向划痕区迁移过划痕的距离。
1.2.6 Transwell实验法检测细胞侵袭 将基质胶添加到Transwell的上部腔室,将培养基溶液添加到Transwell的下部腔室,然后取各组转染后各组细胞1×104个(100 μl)添加到上室,培养72 h时将渗透的细胞用20%甲醇固定并用0.1%结晶紫染色,计数进入每个视野底部室细胞数的平均值即侵袭细胞数。
1.2.7 Western blot检测EMT标记蛋白(E-cadherin、vimentin) 取转染后继续培养的7组细胞收样提取细胞总蛋白,BCA试剂盒测定EMT相关蛋白(E-cadherin、vimentin)浓度,聚丙烯酰胺凝胶电泳(80~120 V,90 min)分离总蛋白并转移至PVDF膜,采用Image J软件分析目标蛋白条带灰度值,GAPDH作为内参。
miR-375、miR-92b与NLK mRNA结合位点见图1。miR-375与NLK靶向关系的双荧光素酶报告实验结果显示:转染NLK-WT的miR-375组A549细胞的相对荧光素酶活性低于miR-375 Con组,差异有统计学意义(P<0.05),转染NLK-MUT的miR-375组A549细胞的相对荧光素酶活性与miR-375 Con组比较,差异无统计学意义(P>0.05,见图2)。
图1 Starbase预测miR-375、miR-92b与NLK mRNA的3′-UTR的靶向结合位点Figure 1 Starbase predicts the targeted binding site of miR-375 and miR-92b to the 3′-UTR of NLK mRNA
miR-92b与NLK靶向关系的双荧光素酶报告实验结果显示:转染NLK-WT的miR-92b组A549细胞的相对荧光素酶活性低于miR-92b-Con组,差异有统计学意义(P<0.05),转染NLK-MUT的miR-92b组A549细胞的相对荧光素酶活性与miR-92b-Con组比较,差异无统计学意义(P>0.05,见图2)。
与相应Con组比较,* P <0.05
在培养72 h时,miR-375阴性对照、miR-92b阴性对照组A549细胞的NLK mRNA表达量低于正常对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);miR-375+miR-92b阴性对照组NLK mRNA表达量与正常对照组比较差异不具有统计学意义(P>0.05);miR-375抑制组、miR-92b抑制组、miR-375+miR-92b抑制组与各自阴性对照组和正常对照组比较,NLK mRNA表达量降低(均P<0.05,见图3)。
与正常对照组比较,aP <0.05;与相应的阴性对照组比较,bP <0.05
在培养72 h时,miR-375阴性对照组、miR-92b阴性对照组A549细胞增殖的OD值低于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05);miR-375+miR-92b阴性对照组与正常对照组OD值差异不具有统计学意义(P>0.05);miR-375抑制组、miR-92b抑制组、miR-375+miR-92b抑制组与各自阴性对照组及正常对照组比较,OD值相对较低,差异具有统计学意义(均P<0.05,见图4)。
与正常对照组比较,aP <0.05;与相应的阴性对照组比较,bP <0.05
在划痕实验后培养72 h,miR-375阴性对照组、miR-92b阴性对照组A549细胞迁移距离低于正常对照组(P<0.05);miR-375+miR-92b阴性对照组与正常对照组细胞迁移距离差异不具有统计学意义(P>0.05);miR-375抑制组、miR-92b抑制组、miR-375+miR-92b抑制组与各自阴性对照组及正常对照组比较细胞迁移距离相对较低(均P<0.05,见图5)。
与正常对照组比较,aP <0.05;与相应的阴性对照组比较,bP <0.05
Transwell实验后培养72 h时,miR-375阴性对照组、miR-92b阴性对照组A549细胞的侵袭细胞数低于正常对照组(P<0.05);正常对照组与miR-375+miR-92b阴性对照组侵袭细胞数差异不具有统计学意义(P>0.05);miR-375抑制组、miR-92b抑制组、miR-375+miR-92b抑制组与各自阴性对照组及正常对照组比较,侵袭细胞数降低(均P<0.05,见图6)。
与正常对照组比较,aP <0.05;与相应的阴性对照组比较,bP <0.05
培养72 h时,miR-375阴性对照组、miR-92b阴性对照组、miR-375+miR-92b阴性对照组与正常对照组比较,E-cadherin、vimentin蛋白表达水平差异不具有统计学意义(P>0.05);miR-375抑制组、miR-92b抑制组、miR-375+miR-92b抑制组与各自阴性对照组及正常对照组比较,E-cadherin蛋白表达水平均显著升高,vimentin蛋白表达水平均显著降低(均P<0.05,见表1和图7)。
表1 miR-375、miR-92b对A549细胞EMT相关蛋白的影响
1.正常对照组;2.miR-375阴性对照组;3.miR-92b阴性对照组;4.miR-375+miR-92b阴性对照组;5.miR-375抑制组;6.miR-92b抑制组;7.miR-375+miR-92b抑制组
肺癌的死亡率逐年增加,而非小细胞肺癌在肺癌患者中占比较高,目前临床治疗中主要采用手术化疗或放疗等方式,但是对于患者总体生存率延长不明显。肿瘤细胞迁移、侵袭是患者治疗后预后不佳的主要原因之一,而EMT则是肿瘤细胞迁移和侵袭能力的生物学表达方式。目前普遍认为EMT在肿瘤复发和转移中起主要作用。在对肿瘤细胞EMT深入研究后,人们发现miRAN等在调控EMT过程中发挥重要作用,miRNA可通过碱基配对方式与相关因子RNA的3′UTR区域结合,这种结合可调节基因表达,最终以转录调控方式对原癌基因和抑癌基因产生影响[12]。通过对miRNA表达谱的研究发现,多种miRNA在NSCLC转移、复发中可发挥作用,如miR-375、miR-92b均是与NSCLC有关的miRNA[13,14]。我们在研究中发现,铂类化疗药物耐药NSCLC患者的miR-375、miR-92b水平明显升高,并且miR-375、miR-92b也是NSCLC化疗反应性和无进展生存期的有效预测生物标志物[15],提示:miR-375、miR-92b与NSCLC进展和耐药有关。本次研究也是在此基础上通过miRNA基因芯片发现,NSCLC中miR-375、miR-92b表达降低,采用软件预测发现,NLK是其共同靶点。因此,进一步研究miR-375、miR-92b调控网络靶向NLK对非小细胞肺癌细胞生物学功能及EMT的影响研究十分重要。
本研究采用脂质体转染技术将NLK-WT和miR-92b(或miR-375)共同转入A549细胞后的NLK-WT荧光素酶活性降低,而采用脂质体转染技术将NLK-MUT和miR-92(或miR-375)共同转入A549细胞后的NLK-MUT荧光素酶活性并无改变,说明miR-375、miR-92b与NLK存在靶向关系。同时miR-375、miR-92b与NLK mRNA均有结合位点,NLK为miR-375与miR-92b的共同靶向分子。可见miR-375、miR-92b调控网络具有靶向调控NLK作用,但其是否对癌细胞产生影响,这仍需要进一步的细胞实验验证。
miRNA抑制剂可以有效抑制内源性成熟miRAN功能,高效长久抑制miRNA活性,其对应阴性对照可以消除非序列特异性的作用效应,从而全面了解抑制剂以及背景效应之间的异同[16]。为进一步分析miR-375、miR-92b调控网络靶向NLK后是否对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞NLK mRNA表达、增殖、迁移、侵袭及上皮细胞-间充质转化(EMT)产生影响,在我们人为改变A549细胞内miR-375、miR-92b、miR-375+miR-92b表达水平,本研究将A549细胞作为研究对象,将其分为正常对照组、miR-375阴性对照组、miR-92b阴性对照组、miR-375+miR-92b阴性对照组、miR-375抑制组、miR-92b抑制组和miR-375+miR-92b抑制组,并进行细胞生物学行为实验,通过实验了解到,正常对照组与阴性对照组虽然差异有统计学意义,但是差异不大,这是因为微小RNA的转染会对细胞本身有一定的影响,正常对照组跟阴性对照组存在一定差异的,对实验目的并未有影响。本结果显示:低表达miR-375、miR-92b调控网络可以抑制NLK的表达,进而抑制NSCLC细胞增殖、侵袭、迁移。李彩红等[17]的研究发现,miR-375抑制后鼻咽癌CNE1细胞增殖、迁移显著高于慢性鼻咽炎抑制剂组(P<0.05),其研究证明在CNE1细胞中miR-375对NLK具有直接靶向调控作用。而在庞湃等[18]的研究中,NLK表达水平受到miR-92b靶向调节,与本次研究有一定的一致性。
NLK作为Wnt家族重要成员蛋白,其是调控Wnt/β-catenin信号通路的关键蛋白,可与β-catenin形成转录复合体,进而调控Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因TAK1-NLK[19]。由于Wnt/β-catenin可以参与调节肿瘤的发生发展,因此认为NLK通过介导Wnt/β-catenin信号通路而作为一个肿瘤抑制因子。NLK还具有免疫调节作用,肿瘤细胞中NLK的升高会使细胞免疫逃逸能力提升,进而促进NSCLC的增殖和转移,从而促进NSCLC进展。Cadherin、vimentin均是肿瘤细胞EMT形成的重要标志。E-cadherin在NSCLC细胞生长晚期可以促进细胞的转移,其促癌的作用通常与宫颈癌肿瘤细胞的EMT同步发生[20]。而vimentin是维持上皮细胞极性和细胞间黏附的主要分子,其主要的功能是其可以形成蛋白复合体连接到肌动蛋白细胞骨架,阻止肿瘤细胞EMT形成,在陈保坤等[21]的研究中,E-cadherin、vimentin对NSCLC细胞EMT形成产生影响。而在本研究中,低表达miR-375、miR-92b调控网络可以抑制NLK的表达,进一步对NSCLC细胞的E-cadherin、vimentin蛋白研究发现,提示低表达miR-375、miR-92b调控网络可以抑制NLK的表达,进而抑制NSCLC的EMT形成。
综上所述,miR-375、miR-92b调控网络靶向NLK可对NSCLC的生物学功能和EMT形成产生抑制作用,NLK表达调控可能是NSCLC的预后生物标志物和治疗靶点。但本研究的局限性在于仅仅为细胞实验,后续可进一步动物实验证实。