新疆维吾尔族寻常型银屑病患者皮损组织中miR-21高表达

王慧琴，赵 洋，吴卫东

(新疆维吾尔自治区人民医院 科研教育中心， 新疆 乌鲁木齐 830000)

银屑病(psoriasis) 是一种慢性、复发性炎性系统性疾病,难以根治，常罹患终身[1-2]。其临床表现为鳞屑性红斑或斑块分布，目前银屑病的发病机制尚不明确，可能的发病诱因与遗传、环境、精神心理等因素相关。新疆地区银屑病高发，且因地域、种族、生活习惯的不同具有自身的特殊性：与代谢性疾病相关的银屑病在本地区表现为易于复发，难于治疗、累及关节损害患者增多。随着表观遗传学的发展，研究发现在银屑病的发生发展中微小RNA(microRNA)异常表达与疾病密切相关[1-3]。目前关于miR-21调控靶蛋白Bcl-2在寻常型银屑病中的作用研究鲜有报道。本研究以 miR-21为切入点，探究其在健康人群与维吾尔族银屑病患者皮损组织中的表达差异，以及靶蛋白Bcl-2的表达情况。进一步转染HaCaT细胞探讨miR-21对靶蛋白的调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例选择：选取2013年至2019年间在新疆维吾尔自治区人民医院皮肤科确诊的51例维吾尔族寻常型银屑病患者为实验组，其中男性26例，女性25例，年龄为8～70岁，平均年龄为(34.3±14.0)岁；对照组来自泌尿外科、整形外科等无皮肤疾病的患者，本研究中取其手术中切除的多余皮肤组织，共选择维吾尔族29例，其中男性18例，女性11例，年龄为8～66岁，平均年龄为(24.3±27.4)岁。所有样本均用于免疫组化检测分析，其中对照组和实验组各15例。纳入标准：所有银屑病患者均经组织病理检测确诊，具有典型皮损症状。排除标准：患者在3个月内使用过维A酸类药物、糖皮质激素等；合并严重心脏、肝、肾等疾病者；合并其他免疫性及肿瘤性疾病者；停止光疗及外用药物治疗>1个月以上；女性患者排除月经期、妊娠期及哺乳期。正常对照组均排除银屑病家族史，且无遗传性疾病史及自身免疫性疾病史。此次研究经新疆维吾尔自治区人民医院伦理委员会批准(审批号：KY2020041048)，参与患者均自愿参加，且签署知情同意书。

1.1.2 试剂：人永生化角质形成细胞系HaCaT(南京凯基生物公司)，核酸提取miRNeasy Mini kit、反转录miScript Ⅱ RT kit、实时荧光定量miScript SYBR® Green PCR kit 试剂盒(Qiagen公司)；Bcl-2单克隆抗体、鼠兔通用型二抗试剂盒和DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；BCL抗体(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR检测miR-21：取冻存组织样本提取总RNA，按照说明书操作执行。提取的样本总RNA浓度及纯度使用Thermo超微量核酸蛋白测定仪进行测定。反转录合成cDNA反应体积为20 μL，37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min。应用试剂盒检测miR-21表达，反应体系20 μL，反应条件：95 ℃ 15 min，1个循环；94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，40个循环。计算2-△△Ct。样本重复3个复孔，基于相同条件下检测miR-21和U6，miR-21引物序列5′-GTGCAG GGTCCGAGGT-3′。扩增结束后采用软件进行数据分析。

1.2.2 免疫组化法检测Bcl-2蛋白表达：石蜡切片使用二甲苯脱蜡及梯度乙醇进行脱水，用Envision二步法染色；PBS缓冲液冲洗；pH6.0的柠檬酸缓冲液修复15 min，PBS缓冲液冲洗；室温下加入过量过氧化氢孵育10 min，在此期间使用蒸馏水冲洗，PBS浸洗；滴加一抗Bcl-2，稀释浓度为1∶500，孵育，4 ℃冰箱贮藏过夜；滴加二抗，室温孵育45 min，使用PBS缓冲液冲洗；DAB显色30 s内终止；而苏木精使用盐酸分化，经过脱水透明后使用中性树胶封片。结果判断：Bcl-2蛋白的阳性显色表现为表皮基底层细胞胞质中出现棕黄色或棕褐色颗粒。结果判定评分是由两名高级职称病理医师进行独立双盲阅片得出。

1.2.3 Western blot检测Bcl-2蛋白表达量：HaCaT细胞培养：含10%胎牛血清的DMEM培养液中添加100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素，37 ℃、5% CO2下培养。miR-21 mimic和miR-21 inhibitor转染时将细胞汇合度控制为40%～60%，转染过程根据说明书执行。转染48 h后收集细胞，RIPA裂解细胞，之后采用BCA法对蛋白浓度测定。SDS-PAGE电泳分离蛋白样本，转印到PVDF膜上，用5%蛋白质干粉TBST封闭1 h，TBST洗膜3次，10 min∕次，一抗(1∶1 000)室温孵育1 h，TBST洗膜如上述操作。二抗同样如此。

1.3 统计学分析

应用SPSS21.0统计软件进行分析，实时荧光定量PCR结果采用LSD法分析。计量资料使用t检验。计数资料采用χ2检验分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-qPCR检测miR-21

miR-21在维吾尔族寻常型银屑病患者皮损组织中的表达水平高于对照组(P<0.05)。miR-21在维吾尔族寻常型银屑病皮损旁组织中的表达要低于皮损组织(P<0.05)(图1)。

*P<0.05 compared with control；#P<0.05 compared with para-lesion图1 寻常型银屑病皮损、皮损旁组织及正常皮肤中miR-21的表达水平Fig 1 Comparison of miR-21 expression levels in lesions, para-lesion of psoriasis vulgaris and normal skin

2.2 免疫组化结果

Bcl-2蛋白阳性表达定位于胞质，在寻常型银屑病与对照组中均有阳性表达。其中对照组中表皮棘层细胞表达有27例，占阳性表达率93.10%(27/29)；在维吾尔族寻常性银屑病组中有18例在表皮棘层细胞表达，阳性表达率为35.29%(18/51)。两组数据经卡方检验分析，实验组即银屑病组阳性率明显低于正常皮肤组织(P<0.001)(图2，表1)。

2.3 Western blot结果

miR-21转染HaCaT细胞后，其过表达可抑制Bcl-2蛋白表达，相反则升高(P<0.001)。与对照组细胞比较， miR-21抑制表达时Bcl-2蛋白表达升高(P<0.001)，过表达时Bcl-2蛋白表达降低(P<0.001)(图3)。

A.Bcl-2 positive expression; B.Bcl-2 negative expression图2 Bcl-2的免疫组织化学检测结果Fig 2 Immunohistochemical results of Bcl-2(IHC×100)

表1 不同皮肤组织中Bcl-2蛋白的免疫组化检测结果

*P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with miR-21 inhibitors图3 miR-21对Bcl-2蛋白表达的影响Fig 3 Effect of miR-21 on Bcl-2 protein expression

3 讨论

银屑病俗称牛皮癣，易复发，难以根治，主要特征为角质形成细胞异常增殖和趋化因子诱导炎性细胞浸润表皮。目前研究认为银屑病是在多基因遗传背景下发生的免疫异常疾病，发病机制复杂[3-5]。银屑病表皮角质异常增生，说明患者表皮角质形成细胞周期存在异常情况[4-6]。研究发现miRNA在调控皮肤病中具有重要的作用[2]，miR-21可能参与了细胞增殖、侵袭及凋亡等多种生物学过程[7-9]。本研究前期发现银屑病皮损组织中miR-21表达异常[9]，那么与细胞凋亡密切相关的miR-21是否通过调控靶蛋白参与了寻常型银屑病表皮角质异常增生的过程？因此本研究选择miR-21为切入点，以维吾尔族寻常型银屑病患者作为研究对象，通过进行实时荧光定量PCR来检测皮损处miRNA表达；并对其调控的下游靶蛋白Bcl-2进行检测。

实时荧光定量PCR检测结果表明：miR-21在维吾尔族寻常型银屑病患者皮损组织中的表达比正常对照高，miR-21的过表达可能参与维吾尔族寻常型银屑病的发病及进展过程。miR-21表达明显上调与芯片筛选以及其他学者的研究结果[11-12]一致。miR-21的异常表达可能调控其靶蛋白共同作用参与了银屑病的发病。本课题组通过生物信息学软件预测Bcl-2为miR-21的靶蛋白，Bcl-2蛋白家族是细胞凋亡的重要调节分子，在线粒体水平决定细胞是否进入凋亡程序，从而在凋亡通路中发挥了重要调节功能[10-12]。

Bcl-2蛋白是家族成员中的抗凋亡蛋白，蛋白C末端疏水区可与细胞器的膜相连；N端跨膜区在Bcl-2抑制细胞凋亡过程中有重要作用[11-12]。Bcl-2蛋白与激活的促凋亡蛋白作用后失去了对细胞凋亡的抑制作用，导致细胞凋亡的发生。本项目免疫组化实验发现：正常皮肤Bcl-2蛋白的阳性表达比维吾尔族寻常型银屑病患者的高，说明银屑病患者皮损处的Bcl-2表达被抑制，通过改变细胞凋亡参与调控银屑病的发生发展过程。银屑病重要病理特征为角质形成细胞异常增殖，因此本研究选择HaCaT细胞作为转染对象，由此观察角质形成细胞的变化过程。免疫印迹法检测结果表明：miR-21过表达可减低Bcl-2蛋白表达，而miR-21抑制表达时则起到促进Bcl-2蛋白表达的作用。HaCaT细胞的变化过程提示其与在体研究结果一致，由此认为miR-21可能调控了Bcl-2蛋白，两者共同作用调节细胞凋亡功能，最终导致使表皮角质增殖异常，从而加速病程进展。