中心组合设计效应面法优化连翘中连翘苷的提取工艺

岑少婷，李植桐

（1.佛山市三水区妇幼保健院，广东佛山 528100；2.广东省第二中医院（广东省中医药工程技术研究院），广东广州 510095）

连翘是清热解毒类中药方剂中的常用药味，具有清热解毒、消肿散结、疏散风热等作用，研究表明连翘提取物、流浸膏等单味药制剂对对感冒发热、丹毒、营卫不调等症也有较好的疗效，且经提取制备单方制剂后便于携带、服用，疗效更佳[1-3]。但与此同时，由于各医疗机构和制药企业仪器设备、人员、工艺水平等因素的影响，所制备的连翘提取物疗效和稳定性相差较大，因此有必要对该药味的提取工艺中的关键参数进行优化和评价。

中心组合设计效应面法基于软件计算和预测，可以根据用户所给参数及范围进行多参数/指标优化考察，相比传统的单因素设计等方面，能够最大限度减少试验次数，获得更加准确的结果[4-5]。因此，笔者拟使用Design Expert 软件进行实验设计，并根据所得各关键参数制备样品，参考文献方法测定连翘提取液中连翘苷的含量[6-7]，再导入上述软件中预测最优结果。

1 仪器与材料

Waters 2695高效液相色谱仪，配制为PDA检测器，自动进样器、四元高压泵和柱温箱，购自美国Waters公司；98-2-C型数显电热套，购自广东佛衡仪器有限公司；HH-2 数显恒温水浴锅，购自江苏国华电器有限公司；ME104T/02 电子分析天平，购自瑞士Mettler-Toledo 公司；连翘苷对照品（批号：110821-201816）购自中国食品药品检定研究院；连翘苷药材购自华润三九药业股份有限公司；样品制备用乙醇为分析纯，购自广州化学试剂厂；供试品制备和含量测定用乙醇、乙腈、冰醋酸为色谱纯，购自德国Merck公司；实验用水购自Watsons公司。

2 方法与结果

2.1 实验参数设计 本研究确定的考察乙醇含量、提取时间、溶剂量三个参数，考察指标为连翘苷含量。将各考察参数输入Design Expert 软件中，乙醇含量范围设定为20%～100%，提取时间范围设定为20～90min，溶剂量范围设定为10～40 倍（溶剂体积/药材量，药材量固定为2g），系统给出的各实验组参数见表1。根据所给参数进行加热回流提取，所得提取液放冷后备用。

表1 CCD各组参数及测定结果

2.2 对照品溶液制备 取连翘苷对照品粉末，精密称取约5mg 置于5mL 量瓶中，加色谱纯乙醇溶解并定容至刻度，得浓度为1mg/mL的对照品溶液，备用。

2.3 供试品溶液制备 取各实验组样品，在水浴锅上浓缩至≤20mL，所得溶液转移至25mL 量瓶中，加色谱纯乙醇稀释并定容至刻度，即得连翘苷标准提取液；分别精密吸取上述提取液1mL，转移至10mL 量瓶中，加色谱纯乙醇稀释并定容至刻度，所得溶液滤过，即得供试品溶液。

2.4 样品含量测定 使用Waters Xbridge 色谱柱（25cm 柱长，0.46cm 内径，5μm 粒径），乙腈（A）-0.4%冰醋酸（B）为流动相，梯度程序为：0～15min，15%-15%A；15～20min，15%-90%A；20～25min，90%-15%A；25～30min，15%-15%A；流速1.0mL/min，检测波长330nm，柱温25℃，进样体积10μL；记录所得HPLC图谱，见图1。

图1 对照品（100μg/mL）和供试品HPLC图谱

2.5 含量测定方法验证

2.5.1 线性和范围 取连翘苷对照品溶液，分别精密吸取不同体积，转移至多个5mL 量瓶中，加色谱纯乙醇稀释并定容，制得浓度分别为10、20、50、100、200、500μg/mL 的对照品溶液，注入HPLC 中，按“2.4”项下所述方法分析测定，记录各样品中连翘苷的峰面积，以峰面积为纵坐标（y）、浓度为横坐标（x），导入Excel 软件进行线性回归，计算得回归方程为y=14532x-1776.1（r2=0.9996）。结果显示：方法线性良好，能够在10～500μg/mL 浓度范围内准确测定连翘苷的含量。

2.5.2 精密度考察 取最优提取条件制备的供试品溶液（简称供试品溶液），注入HPLC 中，按“2.4”项下所述方法分析测定，连续重复6次，记录各样品中连翘苷的峰面积，计算峰面积的RSD。结果显示：RSD为0.84%，表明方法精密度良好。

2.5.3 稳定性考察 将供试品溶液放置在HPLC自动进样器中，分别在0、2、4、6、8、12h 按“2.4”项下所述方法分析测定，记录各样品中连翘苷的峰面积，计算峰面积的RSD。结果显示：RSD为0.62%，表明方法所制备样品在12h内稳定性良好。

2.5.4 重复性考察 平行配制6 份供试品溶液，按“2.4”项下所述方法分析测定，记录各样品中连翘苷的峰面积，计算峰面积的RSD。结果显示：RSD 为0.65%，表明方法重复性良好。

2.5.5 加样回收试验 精密吸取标准提取液0.5mL，转移至10mL量瓶中，按表2所列药量添加连翘苷对照品溶液，混合后加色谱纯乙醇稀释并定容至刻度，所得溶液滤过，即得供试品溶液。吸取上述供试品溶液，注入HPLC 中，按“2.4”项下所述方法分析测定，记录各样品中连翘苷的峰面积，计算含量、回收率和回收率的RSD。结果显示：平均回收率为99.12%，RSD为3.13%，表明方法准确度良好。

表2 加样回收试验结果（n=3）

2.6 样品测定和数据分析 取“2.1”项下各组样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，所得溶液注入HPLC中，按“2.4”项下所述方法分析测定，记录各样品中连翘苷的峰面积，计算含量。所得结果导入Design Expert 中，计算并预测最优提取参数。结果显示：乙醇含量60%、提取时间60min、溶剂量为药材量30 倍时为最优，为0.6152mg/mL，与软件预测结果（图2）相符。

图2 中心组合设计效应面预测结果（n=20）

3 讨论

含量测定结果显示，中心点各组所得样品连翘苷含量最高。产生上述结果，可能是由于：（1）乙醇含量增加时，提取效率上升，但该参数超过中心点后，由于黏度、极性的变化，导致连翘苷溶解度下降；此外含水量较高时，加热回流会导致连翘苷水解，也会一定程度降低得率；（2）随着提取时间延长，连翘苷提取量上升，但由于水解的存在，导致过度延长提取时间时，连翘苷水解量增加，进而影响产量；（3）增加液料比（溶剂-药材比）可以使药材得到充分提取，但其结果受药材中连翘苷总量的影响，因此产量不会随溶剂量的增加而无限增加。综合考虑上述因素，最终选择了中心点作为最优提取参数。

研究表明，使用不同极性溶剂对连翘进行提取时，所得提取物的抗炎活性存在较大差异；同时，该药材水提物虽然提取率较高，且对小鼠足节肿胀模型具有一定抗炎效果，但与模型组相比并无统计学差异[8]。上述结果表明，在优化提取效率时，考察指标的选择尤为关键。另有文献报道显示，连翘提取物与挥发油协同作用，均能够显著降低体内发热相关炎症因子（PEG2、ⅠL-1β、ⅠL-6、TNF-α 等）水平，进而发挥解热抗炎功效。结合连翘苷的药理活性及文献报道的连翘抗炎物质基础可知，连翘醇提物对发热型炎症的抵抗效果较好[10-11]，且醇提物相较乙酸乙酯、正丁醇等有机溶剂毒性低，溶剂残留导致的健康风险更加可控，因此本文选择使用乙醇作为提取溶剂的有机相，具有较好的科学性、合理性。