多重PCR检测生乳及乳制品中产肠毒素金黄色葡萄球菌的研究

陈鹏云 赵永拓 高 军

（鲅鱼圈海关综合技术服务中心，辽宁营口 115000）

金黄色葡萄球菌是引发食源性中毒的一种重要病原体，而牛奶和乳制品是金黄色葡萄球菌生长的良好基质[1～2]。数据显示，当金黄色葡萄球菌菌落计数达到大约106CFU/g时会产生肠毒素[3]。金黄色葡萄球菌肠毒素（SEs）根据其抗原特性分为5种 经典的血清型，分别为SEA、SEB、SEC、SED和SEE[4]；除此之外，近几年有越来越多的新型肠毒素被报道，如SEG、SEH、SEI、SEJ、SEK、SEL、SEM、SEN、SEO、SEP、SEQ、SER和SEU等[5]。研究发现，SEs对胃肠蛋白酶（如胃蛋白酶）和高温灭活具有抗性[6]。在食品安全方面，热稳定性是SEs最重要的特性之一。尽管巴氏杀菌会杀死金黄色葡萄球菌，但具有耐热性的SEs通常会保持其生物活性[7]。金黄色葡萄球菌食物中毒是摄入含有0.02～1 μg SEs的食物后发生的一种轻度中毒，非常低剂量的SEs就会导致人们出现恶心、呕吐、腹部绞痛、腹泻等中毒症状[8]。然而，更为严重的是，随着抗菌药物的大规模使用，很多菌株已经出现耐药性。因此，对生乳及乳制品中产肠毒素的金黄色葡萄球菌菌株及其耐药性进行鉴定和检测显得尤为重要[9]。本研究在从生乳和乳制品样品中分离得到凝固酶阳性葡萄球菌（CPS）的基础上，使用多重聚合酶链式反应（PCR）方法识别出产肠毒素的金黄色葡萄球菌菌株，并对金黄色葡萄球菌菌株的耐药性进行试验。

一、材料与方法

（一）生牛乳和乳制品样品从各零售店收集244个生牛奶和乳制品样品，其中包括生牛奶样品120个、白奶酪样品64个、马苏里拉奶酪样品20个、黄油样品20个和冰淇淋样品20个。所有样品收集后，立即用冷藏箱（4～8℃）运送至实验室，送到实验室后立即进行分析（分析之前保持在4℃温度下储存）。

（二）主要试剂及培养基蛋白胨（北京鸿润宝顺科技有限公司）；Baird-Parker琼脂（上海博湖生物科技有限公司）；兔血浆（上海源叶生物科技有限公司）；EDTA（潍坊滨海石油化工有限公司）；溶菌酶（山东淄博山川药业有限公司）；蛋白酶K（武汉华玖医药科技有限公司）；dNTP（北京百奥莱博科技有限公司）；Taq DNA聚合酶（上海博耀生物科技有限公司）；抗菌药物青霉素G、头孢西丁、庆大霉素、阿米卡星、卡那霉素、妥布霉素、新霉素、四环素、红霉素、螺旋霉素、林可霉素、氧氟沙星、诺氟沙星、克林霉素、氯霉素、甲氧苄啶、磺胺甲恶唑、磷霉素、夫西地酸、新生霉素和杆菌肽均购自湖北九洲康达生物科技有限公司。

（三）主要仪器MJP－150细菌培养箱（上海培因有限公司）；TG18W低温高速离心机（济南千司生物技术有限公司）；HH－ZK4电热恒温水浴锅（郑州卓成仪器科技有限公司）；TCT6－I/II PCR扩增仪（上海江莱生物科技有限公司）。

（四）试验方法

1.凝固酶阳性葡萄球菌的分离。从每个样品中取出10 g，放入装有90 mL体积分数为0.1%的无菌蛋白胨水的无菌塑料袋中。每个样品均质2 min后，将匀浆物涂到Baird-Parker琼脂平板上，并在有氧条件下，37℃持续培养24～48 h。选择5个典型或非典型菌落，并使用兔血浆和EDTA生产凝固酶。

2.DNA提取。将样品重悬浮于50 μL质量浓度为100 μg/mL的溶菌酶溶液中，37℃下孵育10 min。加入100 μg/mL蛋白酶K溶液50 μL和0.1 mol/L Tris－HCl缓冲液（pH 7.5）150 μL，37℃下再培养10 min。接着沸水浴5 min，以12 000 r/min离心5 min，将上清液转移至新的EP管中，此即为用于后续PCR反应的DNA模板。

3.多重PCR条件。PCR反应体系：体积为50 μL，含 有0.2 mmol/L dNTP、1.5 mmol/L MgCl2、20 μmol/L上下游引物、10 mmol/L Tris－HCl（pH 8.3）、1.5 U Taq DNA聚合酶、50 mmol/L KCl、5 μL 10×反应缓冲液、2 μL模板DNA和无菌水。

PCR反应循环参数：95℃下预变性5 min；94℃变 性2 min，55℃退 火2 min，72℃延 伸1 min，循环35次；72℃终延伸7 min。取20 μL多重PCR反应产物，加4 μL染料，加载到2.0%琼脂糖凝胶电泳上，在90 V电压下进行1.5 h电泳后，于紫外灯下观察PCR扩增结果。

4.16S rRNA、nuc和SEs编码基因的测定。通过多重PCR对204株凝固酶阳性葡萄球菌进行了16S rRNA、nuc、SEs编码基因测定，具体引物见表1。

表1 引物序列

5.金黄色葡萄球菌分离株耐药性试验。采用盘扩散法检查金黄色葡萄球菌分离株在MuellerHinton琼脂平板上的耐药性，使用的抗菌药物包括青霉素G（10 IU）、头孢西丁（30 μg）、庆大霉素（10 μg）、阿米卡星（30 μg）、卡那霉素（30 μg）、妥布霉素（10 μg）、新霉素（30 μg）、四环素（30 μg）、红霉素（15 μg）、螺旋霉素（100 μg）、林可霉素（15 μg）、氧氟沙星（15 μg）、诺氟沙星 （15 μg）、克林霉素（2 μg）、氯霉素（30 μg）、甲氧苄啶（1.25 μg）、磺胺甲恶唑（23.75 μg）、磷霉素（50 μg）、夫西地酸（10 μg）、新生霉素（30 μg）和杆菌肽（10 IU）。金黄色葡萄球菌ATCC 25923作为阳性对照菌株。

二、结果与分析

（一）凝固酶阳性葡萄球菌在生乳和乳制品样品中的分布情况本研究中，在128个凝固酶阳性葡萄球菌阳性样品中检测到204株凝固酶阳性葡萄球菌，涉及生牛奶 （90/120，75.0%）、白奶酪（24/64，37.5%）、马苏里拉奶酪（6/20，30.0%）、黄油（6/20，30.0%）和冰淇淋（2/20，10.0%）样品（见表2）。

表2 CPS在生乳和乳制品样品中的分布情况

（二）SEs编码基因检测情况多重PCR检测SEs编码基因结果见表3。结果显示，生牛奶样品中有14株分离株（14/102，13.7%）检出SEs编码基因，其中10株（10/14，71.4%）检出sea基因，2株（2/14，14.3%）检出seb基因，2株（2/14，14.3%）检出sea+seb基因；白奶酪样品中有8株分离株（8/42，19.0%）检出SEs编码基因，其中各有2株（2/8，25.0%）检出sea、sec、sed和sea+sed基因；马苏里拉奶酪样品中有4株分离株（4/8，50.0%）检出SEs编码基因，其中2株（2/4，50.0%）检出sea基因，另2株（2/4，50.0%）检出sed基因；黄油样品中有2株分离株（2/2，100.0%）检出seb基因。

表3 多重PCR检测SEs编码基因结果 （株）

（三）金黄色葡萄球菌分离株耐药性试验结果金黄色葡萄球菌分离株的耐药性试验结果见表4。如表4所示，金黄色葡萄球菌分离株对青霉素G（90.7%）和四环素（47.5%）的耐药率最高。所有金黄色葡萄球菌分离株均对庆大霉素、阿米卡星、氯霉素、磺胺甲恶唑、甲氧苄啶和新生霉素敏感。同时，观察到金黄色葡萄球菌分离株对头孢西丁（16.0%）、氧氟沙星（16.0%）、诺氟沙星（16.0%）、杆菌肽（4.8%）、红霉素（2.4%）、妥布霉素（2.4%）、螺旋霉素（1.2%）、林可霉素（1.2%）、克林霉素（1.2%）、卡那霉素（1.2%）、新霉素（1.2%）、磷霉素（1.2%）和夫西地酸（1.2%）的耐药率较低。

表4 金黄色葡萄球菌分离株的抗菌药物耐药性试验结果

三、讨论

金黄色葡萄球菌是人类和动物中常见的病原体，其被认为是引起食源性中毒的重要原因之一。对于奶牛，金黄色葡萄球菌通常会使其患亚临床乳腺炎，从而导致其产的牛奶受到污染[10]，继而人在食用受污染的牛奶后可能产生中毒症状。金黄色葡萄球菌肠毒素可能形成于牛奶生产的多个程序过程中，例如将有肠毒素存在的乳汁混合到正常牛奶中、巴氏杀菌之前和（或）之后的污染以及冷却过程的错误操作等[11]。此外，奶酪生产链中的错误操作、热处理不当以及保存温度和时间设定不正确等都是产生金黄色葡萄球菌肠毒素的重要因素[12]。

金黄色葡萄球菌的检测和鉴定引起了众多研究者的关注。KARAHAN等[13]报告称，从患有亚临床乳腺炎的奶牛产的牛奶样本中获得了多株金黄色葡萄球菌分离株，通过多重PCR检测从这些分离株中检出一种或多种肠毒素基因（27/92，29.3%）。FOOLADI等[14]发现试验样品中有32%的乳制品（奶油18%、奶酪10%、牛奶4%）被金黄色葡萄球菌污染，同时PCR结果表明，15.6%的金黄色葡萄球菌分离株含有sea基因，9.3%含有seb基因，6.2%含有sea+seb基因。ERTAS等[15]报道了从土耳其安卡拉市场上销售的奶酪中分离出41株产肠毒素金黄色葡萄球菌菌株，其中25%含有sea基因，4%含有seb基因，6%含有sec基因，5%含有sea+sec基因，1%含有sed基因。BULAJIC等[16]发现，在土耳其安卡拉市场销售的100个奶酪样品中，5%的受污染样品中含有金黄色葡萄球菌。这些结果与本研究结果略有差异，这可能与奶酪生产技术不同，以及检测的牛奶样品是生牛奶还是巴氏杀菌过的牛奶有关。

有研究人员从奶酪样品中分离出金黄色葡萄球菌852株，产肠毒素金黄色葡萄球菌的流行率为7.3%[17]。日本研究人 员KATSUDA等[18]在270株金黄色葡萄球菌分离株中，发现有183株（67.8%）含有一种或多种SEs基因。意大利科学家MORANDI等[19]报告称，从牛奶和乳制品中分离出的67%的金黄色葡萄球菌菌株含有SEs基因。NORMONNO等[20]报道了从乳制品中分离出的125株（59.8%）产肠毒素金黄色葡萄球菌的肠毒素基因型。GUCUKOGLU等[21]在16种（16.8%）水果冰淇淋和2种（6.6%）香草冰淇淋中发现了CPS，并获得了16株产肠毒素金黄色葡萄球菌的肠毒素基因型，包括9%sea基因、3%sea+seb基因、2%sea+sed基因、1%sec+sed基 因 和1%sea+seb+sec基因。这些结果与本研究结果相似。

四、结论

本研究对244个生乳和乳制品样品中产肠毒素金黄色葡萄球菌的流行情况进行了调查，结果发现在128个凝固酶阳性葡萄球菌阳性样品中检测到204株凝固酶阳性葡萄球菌。同时，采用多重PCR检测了SEs编码基因sea、seb、sec和sed。结果发现，生 牛 奶 样 品 中 有14株 分 离 株 （14/102，13.7%）检出SEs编码基因，其中10株检出sea基因，2株检出seb基因，2株检出sea+seb基因；白奶酪样品中有8株分离株（8/42，19.0%）检出SEs编码基因，其中各有2株分离株检出sea、sec、sed和sea+sed基因；马苏里拉奶酪样品中有4株分离株（4/8，50.0%）检出SEs编码基因，其中2株检出sea基因，另2株检出sed基因；黄油样品中有2株分离株（2/8，25.0%）检出seb基因。使用盘扩散法进行耐药性试验，发现这些样品中的金黄色葡萄球菌分离株对青霉素G和四环素的耐药率最高。