受控堆肥条件下可降解材料最终需氧生物分解能力测定的不确定度评定研究

林健辉，卢嘉慧，吴欣颖，范雪滢，邓桂荣，高 亮，梅承芳，杨永刚

（广东省科学院微生物研究所，广东省微生物分析检测中心，华南应用微生物国家重点实验室，广东省菌种保藏与应用重点实验室，广州 510070）

0 前言

目前，全球范围内对可降解塑料的关注越来越广泛，各国纷纷制定了有利于推广降解塑料的政策[1]，以促进生物可降解塑料的研究开发。2021年9月，国家发展改革委和生态环境部印发“十四五”塑料污染治理行动方案的通知，其中要求科学稳妥推广塑料替代品，开展不同类型可降解塑料降解及影响研究，科学评估其环境安全性和可控性[2]。对于可降解塑料的降解性能测试，包括需氧生物分解试验、厌氧生物分解试验、崩解性能试验等，目前已有完善的测试标准体系与评价体系。而对于可降解塑料的出口，国内产品的降解性能在满足国内外标准要求的同时，还需要满足国外相关产品认证的要求，如欧盟的“Seeding”认证和“OK compost”认证、美国的“BPI”认证、日本的“Greenpla”认证等。对于各国不同的认证体系，为保证测试结果具有等效性，以避免不必要的重复检测，需要在提供测试结果的同时，附上测试结果的不确定度范围。

不确定度用于描述测量结果时，其含义为定量表示测量结果的不确定程度。1993年，由国际标准化组织（ISO）出版发行了《测量不确定度表示指南》（Guide to the expression of uncertainty in measurement，简称GUM），并于1995年及2008年发布了GUM的修订版。GUM的约定规则使不同国家、不同地区、不同学科和不同领域，在表示测量结果及其不确定度时具有一致的含义。通过规范和统一测量不确定度评定与表示方法，促进了各国测量结果的可比性及互认，使不同实验室对同一样品的测量结果能够进行有意义的比较，从而让世界各地的用户可以方便地判断结果的等效性，避免不必要的重复检测。

对于可降解塑料降解性能的不确定度评定，区别于传统物理、化学指标的测试过程，塑料降解性能的测试由于涉及到微生物作用，因此需要较长的试验周期。以测定可降解塑料的最终需氧生物分解能力为例，其试验周期短则需要45天，最长可至6个月，由此导致塑料降解性能测试的不确定度的评定过程，较常规的物理、化学指标测试更复杂，而目前国内也尚未有相关的文献可供参考。本研究以塑料最终需氧生物分解能力试验为例，依据实验室开展相关试验的实际数据，开展测量不确定度评定，通过计算各不确定度分量的大小，并根据各分量的合成方法，对其进行归一化及可视化处理，从而确定试验过程中主要的不确定度分量，明确可降解塑料需氧生物分解能力测试过程的关键影响因素，并对如何简化其标准不确定度的计算开展研究，同时也为试验周期较长的塑料降解性能测试项目如何开展不确定度评估提供思路。

1 实验部分

1.1 主要原料

微晶纤维素，薄层色谱用TLC，国药集团化学试剂有限公司；

接种物，肥龄2～5个月，自制。

1.2 主要设备及仪器

电热恒温鼓风干燥箱，DHG-9076A，广东环凯微生物科技有限公司；

电子天平，MS205DU，梅特勒托利多科技（中国）有限公司；

电子天平，YP50001，上海力辰邦西仪器科技有限公司；

数显恒温水浴锅，HH-12，常州澳华仪器有限公司；

数显滴定仪，Titrette，德国BRAND公司；

总有机碳分析仪，TOC-L，岛津企业管理（中国）有限公司。

1.3 样品制备

试验材料经液氮低温研磨后，过0.25 mm筛备用。

1.4 性能测试与结构表征

依据GB/T 19277.1—2011《受控堆肥条件下材料最终需氧生物分解能力的测定采用测定释放的二氧化碳的方法第1部分：通用方法》[3]测定可降解塑料的最终需氧生物分解能力。

将接种物与制备好的试验材料（或参比材料）以总干固体约6∶1的比例称量至试验容器中并混合均匀，置于（58±1）℃的水浴锅中培养。在试验容器中通入除二氧化碳（CO2）空气，并用氢氧化钠吸收液吸收试验容器中产生的二氧化碳。试验开始的前45 d，每天测定一次CO2产量，45 d后，每3 d测定一次CO2产量直至试验结束。将试验周期内试验材料组（或参比材料组）的累积CO2产量扣除空白对照的累积CO2产量，计算得到试验材料（或参比材料）的需氧生物分解率。

2 不确定度的数学模型

试验材料的Dt由式（1）计算得到：

式中Rc——每个含有试验混合物的堆肥容器累计放出的CO2量，g

Rc-B——空白容器累计放出的CO2量，g

Rt——试验材料产生的CO2理论释放量，g

根据试验材料的Dt计算公式，可知其主要的不确定度分量为Rt、Rc和Rc-B。对于试验过程中其他影响因素，如通气的气体流速、培养温度的变化及差异等，通过设置平行试验，利用平行试验的重复性计算其对不确定度产生的影响。

2.1 试验材料产生的CO2理论释放量Rt

Rt由式（2）计算得到：

式中MTOT——试验开始时加入堆肥容器的试验材料中的总干固体，MTOT=60 g

CTOT——试验材料中总有机碳与总干固体的比，g/g

44——CO2的分子量（MCO2）

12——C的原子量（MC）

2.2 试验材料组及空白试验组的Rc和Rc-B

2.2.1 CO2产量（R）

为得到CO2的累计量Rc，首先需要测定一定时间内的CO2产量（R），可由式（3）计算得到：

式中R——CO2产量，g

CHCl——盐酸标准溶液的浓度，mol/L

V滴定——盐酸标准溶液的滴定体积，mL

VNaOH-0——CO2吸收瓶中氢氧化钠吸收液的体积，mL

VNaOH-1——滴定氢氧化钠吸收液时，氢氧化钠的取样体积，mL

2.2.2 Rc和Rc-B

试验材料组CO2的Rc和Rc-B可由式（4）计算得到：

式中Rc-i——试验材料组第i次测得的CO2产生量，g

Rc-B-i——空白试验组第i次测得的CO2产生量，g

n——试验全程CO2测量的总次数

3 量化不确定度（u）来源

3.1 试验材料产生的CO2理论释放量（R）t的不确定度u（R）t

3.1.1 试验材料干固体含量的不确定度u（Wdm）

试验材料的干固体含量（Wdm，%）由式（6）计算得到：

式中m0——带盖容器的质量，g

m1——带盖容器及试验材料的总质量，g

m2——带盖容器及烘干恒重后试验材料的总质量，g

m0、m1和m2均使用万分之一分析天平称量确定，其不确定度主要来自3个方面：（1）由天平称量不准引入的不确定度，采用B类方法评定；（2）称量重复性，采用A类方法评定；（3）天平的可读性引入的不确定度，由于天平分辨力比天平最大允许误差小一个数量级，可忽略不计。

（1）天平称量引入的不确定度

分析天平的最大允许误差为±0.5 mg，误差区间半宽度a（m）=0.5 mg，按均匀分布，包含因子k(m)=，称量时先在天平上铺上称量纸，调零后进行称量，即每一次称量过程包含两次称量，由此引起的标准不确定度为：

根据式（7～9），计算得到Wdm两个平行双样测定结果的标准不确定度分别为u1=0.008 14%和u2=0.008 13%，则平行双样的平均值的标准不确定度为：

（2）称量重复性引入的不确定度

称量重复性引入的不确定度采用A类不确定度评定方法，通过极差法计算，Wdm平行双样测定结果的极差（R）为0.045 4%，fWdm重复性的标准不确定度u（fWdm重复性）为：

综合天平称量和称量重复性引入的不确定度，试验材料干固体含量Wdm的标准不确定度u（Wdm）及相对标准不确定度ure（lWdm）为：

3.1.2 试验材料总干固体质量的不确定度u（MTOT）

根据测得的干固体含量Wdm=99.5%，总干固体质量MTOT=60 g，可计算得到需称量的试验材料的质量M试验材料为60.3 g。M试验材料的称量使用十分之一电子天平称量确定，其不确定度来源同3.1.1小节。其中，十分之一电子天平的最大允许误差为±0.5 g，区间半宽度a（M试验材料）=0.5 g；而由于试验材料采用准确称量的方法，所以其标准偏差均为0.0 g，由此得到标准不确定度u（fM重复性）及相对标准不确定度ure（lfM重复性）均为零。

则总干固体MTOT的相对标准不确定度ure（lMTOT）及标准不确定度u（MTOT）为：

3.1.3 CTOT的不确定度u（CTOT）

试验材料中总有机碳与总干固体的比（CTOT，g/g）由式（16）计算得到：

式中rTOC——试验材料总有机碳含量，%

rTC——试验材料中总碳含量，%

rTIC——试验材料中总无机碳含量，%

试验材料总有机碳含量的测定通过总有机碳分析仪测定，分别测定其总碳含量和总无机碳含量后，使用差减法计算得到，其标准不确定度u（rTOC）由u（rTC）和u（rTIC）合成得到。总碳及总无机碳的不确定度分量主要包括标准曲线校准、样品称量及测量重复性所带来的不确定度。综上，u（CTOT）及各不确定度分量的计算详见表1。

表1 试验材料总有机碳含量测定各不确定度分量Tab.1 Uncertainty components of total organic carbon

3.1.4 CO2分子摩尔质量(MCO2)与碳原子摩尔质量（MC）的不确定度u（MCO）2和u（MC）

查2005年IPUCA发布的元素相对原子质量表，碳（C）的相对原子质量[Ar(C ) ]和标准不确定度值为12.017±0.008，氧（O）为15.999 4±0.000 3，u（1MCO）2与u（1MC）分别为：

根据Rt的计算式，MCO2与MC均修约至个位数，其数值修约间隔δ=1，则误差区间半宽a=0.5；按均匀分布，由数值修约产生的标准不确定度为：

则MCO2的标准不确定度u(MCO2)及相对标准不确定度ure（lMCO2）为：

MC的标准不确定度u（MC）及相对标准不确定度ure（lMC）为：

3.1.5 试验材料产生CO2理论释放量的不确定度u（R）t

试验材料的Rt=105.16 g，其相对合成标准不确定度ure（lRt）及标准不确定度u（R）t分别见式（24～25）。

3.2 CO2产量（试验第1天-平行1）的测量不确定度u（R1-1）

3.2.1 盐酸滴定体积的不确定度u（V滴定）

盐酸滴定使用数显滴定仪进行滴定，其不确定度主要来自3个方面：（1）由数显滴定仪滴定不准引入的不确定度，采用B类方法评定；（2）温度变化对液体体积的影响，采用B类方法评定；（3）滴定重复性如每次滴定时，对滴定终点的判断造成的差异等，采用A类方法评定，包含在f试验组重复性及f空白组重复性中，不再重复计算。

（1）数显滴定仪引入的不确定度

数显滴定仪的最大允许误差依据仪器校准证书以及《移液器检定规程》（JJG 646—2006）[4]，为±0.03 mL；按三角分布，其标准不确定度u（V滴定-s）为：

（2）滴定过程中温度变化引入的不确定度

试验第1天，3平行试验中，平行1的V滴定-1=1.64 mL，实验过程中温度变化为±3℃，水体积膨胀系数为2.1×10-4/℃-1；按均匀分布，则温度变化影响液体体积的不确定度u（V滴定-T）为：

综合数显滴定仪和滴定过程中温度变化引入的不确定度，盐酸标准溶液滴定体积V滴定的标准不确定度u（V滴定-1）及相对标准不确定度ure（lV滴定-1）分别为：

3.2.2 盐酸标准溶液浓度的不确定度u（CHCl）

盐酸标准溶液浓度的不确定度的计算参考《化学试剂 标准滴定溶液的制备》（GB/T 601—2002）附录B[5]，主要的不确定度分量及标准不确定度u（CHC）l详见表2。

表2 盐酸标准溶液各不确定度分量Tab.2 Uncertainty components of hydrochloric acid standard solution

3.2.3 NaOH吸收液体积的不确定度u（VNaOH-0）

CO2吸收瓶中的NaOH吸收液用500 mL的量筒量取，每个CO2吸收瓶中含有VNaOH-0=400 mL NaOH吸收液。对于VNaOH-0的不确定度来源，可参考第3.2.1节计算，其中500 mL量出式量筒的容量允差依据《玻璃量具校准规程》（JJG 196—2006）[6]，为±5.0 mL。则NaOH吸收液体积VNaOH-0的标准不确定度u（VNaOH-0）及相对标准不确定度u（VNaOH-0）分别为：

3.2.4 NaOH吸收液取样体积的不确定度u（VNaOH-1）

用10 mL移液枪从吸收瓶中移取氢氧化钠吸收液VNaOH-1=5.00 mL。对于VNaOH-1的不确定度来源，可参考3.2.1小节，其中移液器的最大允许误差依据仪器校准证书以及《移液器检定规程》（JJG 646—2006）[4]，当移取体积为5.00 mL时，其最大允许误差为±0.03 mL。则氢氧化钠吸收液取样体积VNaOH-1的标准不确定度u（VNaOH-1）及相对标准不确定度u（VNaOH-1）分别为：

3.2.5 CO2产量（试验第1天-平行1）测量的不确定度u（R1-）1

试验第1天，3平行试验中，平行1的CO2产量R1-1=2.84 g/瓶，其相对合成标准不确定度ure（lR1-1）及标准不确定度u（R1-1）分别见式（34～35）。

3.3 CO2累计产量的不确定度u（Rc）及 u（Rc-B）

参考章节3.2，计算试验过程1～90 d试验材料组的标准不确定度及相对标准不确定度，则试验材料组（平行1）CO2累积量的标准不确定度u（Rc-1）与相对标准不确定度urel（Rc-1）分别为：

同理可计算试验材料组平行2及平行3的标准不确定度及相对标准不确定度，最后再计算得到CO2累积量平均值的标准不确定度及相对标准不确定度。

用同样的方法，计算得到空白试验组CO2累积量平均值的标准不确定度及相对标准不确定度。

根据试验材料组及空白试验组的平行结果，通过A类不确定度评定，分别计算f试验组重复性及f空白组重复性的标准不确定度，由于平行测定的数据只有3组，即n=3＜10，实验标准偏差有可能被严重低估，故引入安全因子h[7]，计算式为：

综合考虑各不确定度分量，试验材料组及空白试验组的标准合成标准不确定度，详见表3。

表3 CO2总产量的标准不确定度Tab.3 Uncertainty of the cumulative amount of CO2

3.4 合成标准不确定度uc（Dt）

试验材料生物分解百分率的测定各分量的不确定度汇总如表4所示。其中，试验材料的Dt、Dt的相对合成标准不确定度ucrel（Dt）及uc（Dt）分别为：

表4 试验材料生物分解百分率的测定各分量的不确定度Tab.4 Uncertainty components of the percentage biodegradation

3.5 扩展不确定度及不确定度报告

扩展不确定度U（Dt）通过使用k=2计算得到：

根据GB/T 19277.1—2011规定的测量程序，试验材料生物分解百分率Dt=（80.8±9.0）%（k=2）。

4 不确定度分量拆解的可视化及计算简化

从不确定度的评定结果可见，影响生物分解百分率Dt的主要不确定度分量主要为试验材料的CO2理论释放量Rt，以及试验材料和空白对照的CO2释放量的差值Rc-Rc-B，其合成式为：

对于Rt，其不确定度分量又主要包括了试验材料干固体含量MTOT、试验材料的总有机碳与总干固体的比CTOT以及CO2分子量和碳原子的摩尔质量；而Rc-Rc-B的不确定度分量则由Rc和Rc-B合成得到。因此，可根据文中各类不确定度分量的合成式通过数学运算带入式（44）中，并进行归一化处理，通过作图即可清晰得到各不确定度分量在中的占比，如图1所示。

图1 Dt不确定度分量的拆解及其占比Fig.1 Proportion of uncertainty component of Dt

4.1 影响Dt的主要的不确定度分量

从图1中可见，影响Dt的主要的不确定度分量来源于f试验组重复性、f空白组重复性、C 原子量位数（MC）修约、fTC重复性和mTC，其中f试验组重复性、f空白组重复性、fTC重复性均为A类不确定度评定，为试验重复性的影响，要减少其带来的不确定度，需从实验室环境、人员，仪器等方面入手，通过减小平行样间的精密度，来减小其对Dt的影响。

对于mTC，其来源于TOC测定时样品的称样量，其不确定度由分析天平的最大允许误差决定，同章节3.1.1，即：

由式（45）可见，除非更换更精密的分析天平，如十万分之一天平，否则u（mTC）无法降低，但是对于mTC的相对标准不确定度，其计算式为：

则由上式可见，在u（mTC）不变的情况下，可以通过增加mTC，即样品的称样量，来减小urel（mTC），从而最终减小Dt的不确定度。因此，应在满足标准曲线线性范围的情况下，应尽可能增加样品的称样量。

对于MC位数修约的不确定度如章节3.1.4。因修约至整数位，即数值修约间隔δ为1，误差区间的半宽a为0.5，其计算式为：

根据2005年IPUCA发布的元素相对原子质量表可知，碳的相对原子质量是12.017，则在计算Rt时，由原来的取值12改为取值12.017，则此时MC位数修约的不确定度u（2MC）=0，不再影响Dt的不确定度。

4.2 主要的不确定度分量的优化

通过增加样品称样量mTC（在满足标准曲线线性范围的情况下，将称样量由15.8 mg增加至40.0 mg），及修改Rt的计算式（取MC=12.017，MCO2=44.016），对测试过程进行优化，重新计算Dt的标准不确定度，得到uc（Dt）从4.5%降低为3.5%，相对标准不确定度ucrel（Dt）从5.61×10-2降低至4.29×10-2，详见表5。优化后的Dt不确定度分量的拆解及占比详见图2。从图2可见，通过实验优化，Dt的不确定度分量集中在f试验组重复性、f空白组重复性和fTC重复性3项A类不确定度，其他的不确定度分量由于贡献系数较小，如每天滴定CO2产量所产生的不确定度、盐酸标准溶液的不确定度、干物质含量的不确定度、实验过程中所有天平称量、液体量取等等步骤产生的不确定度等B类标准不确定度，均可忽略。

图2 优化后的Dt不确定度分量的拆解及其占比Fig.2 Proportion of uncertainty component of Dtafter optimization

表5 优化前后的uc（Dt）与ucrel（Dt）Tab.5uc（Dt）and ucrel（Dt）before and after optimization

Dt简化后的相对标准不确定度ucrel（Dt）的计算式为：

则其标准不确定度uc（Dt）为：

如表6所示，对比简化前后的结果，简化后的标准不确定度uc（Dt）为简化前的91.4%，简化后的相对标准不确定度ucrel（Dt）为简化前的92.8%。由此可见，通过对Dt的标准不确定度分量进行拆解分析，并对部分较大的不确定度分量通过实验程序优化后，仅仅只需通过3项A类标准不确定度评定，就能快速计算出Dt的标准不确定度，简化计算后得到的结果包含了90%以上的经过完整计算的uc（Dt）。

表6 简化前后的uc（Dt）、ucrel（Dt）与Uc（Dt）Tab.6uc（Dt），ucrel（Dt）and U（Dt）before and after simplification

5 结论

（1）根据GB/T 19277.1—2011规定的测量程序，测得试验材料Dt为80.8%，通过开展测量不确定度评定，得到其标准不确定度uc（Dt）为4.5%；通过拆解影响Dt的不确定度分量，根据各分量的合成方法，对其进行归一化及可视化处理，得到Dt的主要不确定度分量来源于f试验组重复性、f空白组重复性、MC位数修约、fTC重复性和mTC；通过增加样品称样量mTC及修改Rt的计算式，对测试过程进行优化，优化后的uc（Dt）从4.5%下降到3.5%；

（2）经过优化，Dt的不确定度分量主要集中在f试验组重复性、f空白组重复性和fTC重复性3项A类不确定度，其不确定度评定公式可相应的进行简化，简化后计算得到的结果uc（Dt）=3.2%，为简化前结果的91.4%，在保证不确定度准确性的前提下，大大简化了不确定度的计算过程。