高效液相色谱法测定黄酒中苯甲酸含量的不确定度评定

苗 茜，张新中，彭 涛，刘笑笑

（兰州市食品药品检验检测研究院，甘肃兰州 730050）

黄酒以糯米、黍米等为原料，经过蒸料，拌以麦曲或米曲，进行糖化和发酵酿制而成[1]。黄酒以其浓郁的香气、醇厚的风味、丰富的氨基酸、有机酸和维生素而广受消费者喜爱。然而，一些商家选择添加苯甲酸这一广谱抗微生物试剂来达到减缓微生物繁殖、延长保存期限的目的[2]。《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）规定黄酒中不允许添加苯甲酸这一类防腐剂[3]。如果人们长期摄入过量的苯甲酸，会造成慢性苯中毒[4]，对人体造成严重损伤。通过黄酒中苯甲酸含量的不确定度的评定，分析不确定度来源，确定关键影响因素，不仅能够保证黄酒中苯甲酸含量测定值的可靠性，也为提高实验室检验检测能力提供数据参考，为实验室质量控制提供技术指导。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

样品：市售黄酒一批（13%VOL）。

标准物质：苯甲酸（德国Dr.Ehrenstorfer GmbH，含量99.50%）。

试剂：甲醇（默克化学试剂，色谱纯）、乙酸铵（国药集团化学试剂，分析纯）。

仪器：高效液相色谱仪（岛津LC-20A）；万分之一电子天平（梅特勒，ME204）；涡旋振荡器（IKA，vortex2）；超纯水机（密理博，Milli-Q）；高速离心机（艾本德，5810R）；超声提取仪（新芝，SB-800DT）。

1.2 实验方法

1.2.1 供试样样品处理

精密称取供试品（约2 g，精确至0.000 1 g）于50 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，转移至离心管中，3 900 r·min-1高速离心10 min，取上清液过0.22 μm水膜供液相色谱仪测定。

1.2.2 标准溶液配制

苯甲酸储备液配制：精密称取对照品99.50%苯甲酸11.01 mg至10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成浓度为1.095 mg·mL-1的标准溶液。

苯甲酸系列浓度溶液配制：准确移取苯甲酸贮备液0 mL、0.01 mL、0.02 mL、0.04 mL、0.08 mL、0.16 mL 和0.24 mL 于10 mL 容量瓶中，定容配制成0 μg·mL-1、1.095 μg·mL-1、2.190 μg·mL-1、4.380 μg·mL-1、8.760 μg·mL-1、17.520 μg·mL-1和26.280 μg·mL-1系列浓度溶液。

1.2.3 计算公式

样品中苯甲酸含量按式（1）计算。

式中：X为计算得出的苯甲酸含量，mg·kg-1；C为由标准曲线拟合出的样品中苯甲酸含量，μg·mL-1；V为样品定容体积，mL；m为样品称样量，g；F为稀释倍数。

1.2.4 样品测定

称取两份黄酒样品，称样量分别为2.119 1 g 和2.000 5 g，经前处理后上液相色谱仪测定，通过色谱峰面积和标准曲线计算出样品中苯甲酸的浓度分别为1.541 μg·mL-1及1.740 μg·mL-1，求得样品中苯甲酸的含量为0.036 36 g·kg-1和0.043 49 g·kg-1，苯甲酸含量平均值为0.039 92 g·kg-1。

2 不确定度来源分类与分析

根据国家计量技术规范《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2014）进行分类，苯甲酸测定不确定度的来源主要有A类不确定度和B类不确定度。其中，测量结果重复性（n）属于A 类不确定度；而样品称量（m）、样品定容（V）、标准溶液配制（s）、最小二乘法拟合标准工作曲线（C）以及加标回收率（rec）则属于B 类不确定度[5-8]。

2.1 样品称量过程引入的不确定度urel(m)

（1）使用万分之一天平（分辨率为0.1 mg）称量0 ～50 g 时最大允许误差为±0.5 mg，按均匀分布，则不确定度：u1(d)==0.029mg，u1(m)== 0.29mg。

（2）供试品约5 g，取5 g 砝码，重复称重10 次，标准偏差为0.001 2 g，即1.2 mg。

样品称量的相对不确定度为urel(m)=

2.2 定容过程引入的不确定度urel(V)

（1）评定容量瓶配制溶液时的重复性带来的标准偏差。对50 mL A 级容量瓶定容并称重10 次，根据重量数值求其标准偏差，得到其标准偏差为0.050 mL。

（2）标定容量瓶带来的标准偏差。50 mL A 级单标线容量瓶允许误差为±0.05 mL，按三角分布，则u1(r)== 0.021mL。

（3）由温度效应引入的不确定度。假设定容在（20±3）℃条件下进行，水的体积膨胀系数为2.1×10-4，u1(t)== 0.018mL。

样品定容过程中引入的相对不确定度为

2.3 苯甲酸标准溶液引入的不确定度urel(s)

2.3.1 苯甲酸标准物质含量引入的不确定度

2.3.2 标准物质称量引入的不确定度

（1）标准物质称量需使用分辨率为0.01 mg 的天平，当称样量在0～5 g 时，允许误差为±0.05 mg，按均匀分布，则不确定度为

（2）对照品称样量约10 mg，对10 mg 砝码称重10 次，根据10 次称量值计算得出标准偏差为0.000 012 g，即0.012 mg。

标准物质称重引入的相对不确定度为

2.3.3 配制苯甲酸标准使用溶液引入的不确定度

使用容量瓶（25 mL、10 mL）和单标线移液管（5 mL、1 mL）来配制标准溶液。

（1）25 mL A 级容量瓶不确定度。容量瓶定容过程中允许误差±0.03 mL，按三角分布，则u2(r)== 0.012mL。在（20±3）℃条件下进行测量，则温度引入的不确定度：

其实，这只是里根演说前测试麦克风时的一句玩笑话。不过，当这段言论传至苏联后，苏联不仅发表公开声明谴责里根，还一度向特种部队司令部命令“进入战斗状态”，美苏险由此引发战争。

容量瓶重复性产生的相对标准不确定度如下。容量瓶中加水定容至刻度后称重，重复10 次。根据测得重量值求得到其标准偏差为0.012 mL。

（2）10 mL A 级容量瓶不确定度。容量瓶定容过程中允许误差±0.020 mL，按三角分布，则u3(r)== 0.008 2mL。在（20±3）℃条件下进行测量，则温度引入的不确定度：

容量瓶重复性产生的相对标准不确定度如下。容量瓶中加水定容至刻度后称重，重复10 次。根据测得重量值求得其标准偏差为0.008 mL。

则标准溶液稀释定容引入的标准不确定度为

（3）1 mL A 级单标线移液管引入的不确定度。移液过程移液管允许误差为±0.007 mL，按三角分布，则u1(y)== 0.002 9mL。在（20±3）℃条件下进行测量，则温度引入的不确定度：

移液管重复性产生的相对标准不确定度如下。移液管准确移取纯水后称重，重复10 次。根据测得重量值求得其标准偏差为0.001 1 mL。

则标准溶液稀释定容引入的标准不确定度为

（4）5 mL A 级单标线移液管引入的不确定度。移液过程移液管允许误差为±0.015 mL，按三角分布，则u2(y)== 0.006 1 mL。在（20±3）℃条件下进行测量，则温度引入的不确定度

移液管重复性产生的相对标准不确定度如下。移液管准确移取纯水后称重，重复10 次。根据测得重量值求得其标准偏差为0.001 9 mL。

则标准溶液稀释定容引入的标准不确定度为

（5）标准溶液配制过程中稀释引入的不确定度。标准溶液配制过程中，使用25 mL 和10 mL 容量瓶分别为2 次和6 次；5 mL 和1 mL 移液管分别为5次和6 次，则相对不确定度为

因此，标准使用溶液引入的不确定度

2.4 标准曲线计算引入的不确定度urel(C)

由标准曲线拟合引入的标准偏差计算公式为

本实验中标准曲线方程为Y=64 186.7X-2 803.74。

由表1 计算，可得标准溶液系列浓度及响应值如表1 所示。

表1 标准溶液系列浓度及响应值

2.5 回收率引入的不确定度urel(rec)

由于样品溶液不均匀或者实验过程造成样品的污染等因素，不可能100%的加以回收，本方法的加标回收率101%～103%，根据《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012），b+=(103-100)%=3%，b-=(101-100)%=1%，则

2.6 重复测定6 次引入的不确定度urel(n)

表2 样品独立测定结果

2.7 总合成不确定度

表3 各组分相对不确定度

黄酒中苯甲酸含量为0.039 92 g·kg-1时，合成不确定度为0.039 92×0.042=0.001 7 g·kg-1，置信概率为95%时，k=2，扩展相对不确定度为0.003 4 g·kg-1。即称样量约为5 g 时，苯甲酸测量结果为0.039 92 g·kg-1，扩展不确定度为0.003 4 g·kg-1，k=2。

3 结论

基于高效液相色谱技术测定黄酒中苯甲酸的含量，通过分析操作过程中每个环节引入不确定度，发现标准工作曲线拟合对结果的准确性影响最大，苯甲酸加标回收率和标准溶液的配制方法对结果影响较大。因此，在标准溶液稀释混匀和样品溶液转移过程中不能有漏液和转移不充分的情况，应严格按照标准步骤进行，注意细节操作，以保证回收率的稳定。另外，应选择等级较高的标准品和量器（玻璃量器和移液器）来配制标准溶液系列浓度。测量时样品浓度应尽量在标准溶液系列浓度中间区域，必要时可增加样品的测定次数。通过分析和比较各个分量的相对不确定度，掌握影响真值的关键因素，不仅能有效提高数据准确性，也为实验室质量控制提供有效依据。