木姜子挥发油成分分析及抑菌活性研究

陈彦宏, 张鑫瑶, 陈旺, 肖汉永, 周莉君

四川农业大学生命科学学院，四川 雅安 625000

木姜子（Litsea pungensHemsl.）是樟科木姜子属落叶小乔木，主要分布在我国南方和西南地区，两湖、川、桂、贵、云、甘、豫、陕等地均有野生资源分布[1]。木姜子属的植物种类众多，但成分都比较类似，往往富含黄酮类和萜类化合物，尤其是单萜和倍半萜是该属植物中丰富的生物活性成分[2]。作为我国传统的本土药材，木姜子被用于治疗风寒湿痛、跌打肿痛、产后水肿和寒邪等[3]。木姜子的果和叶能健脾，可治疗消化不良、腹泻、中暑，以及作为外用止痛药；茎能治疗胃胀；根可止痛以及治疗胃痛和关节痛[4,5]。它的叶、花和果都富含挥发油，可作为食用香精和化妆香精，应用广泛。张振杰等从秦岭太白山的木姜子叶中检测到1,3,3 -三甲基-乙-氧杂双环[2,2,2]辛烷和l,8-桉油醇等成分[6]。曾朝懿等分别采用水蒸气蒸馏法、超声辅助法、微波辅助法和超临界CO2萃取法提取并测定木姜子花蕾的挥发油成分，发现4种方法所得成分有差异但主成分一致，含量最高均为柠檬醛和柠檬烯[7]。这些成分使他们具有了良好的杀虫[8,9]、化感[10]等生物活性，但目前对于木姜子挥发油抑菌活性和机理的研究却比较少。而对其同属植物山苍子的抑菌研究发现，山苍子对多种病原菌具有良好的抑制作用[11-13]。

果生刺盘孢菌（Colletotrichumz fructicola）是引起油茶炭疽病的优势致病菌，分布范围极广[14,15]。尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporium）是一种危害严重的土传病原真菌，可侵染上百种具有重要价值的作物，引起作物枯萎导致根腐病，是世界十大植物病原真菌之一[16]。目前对于这些常见病原菌的防治主要以化学防治为主，但长期使用化学防治会带来严重的环境污染和对人畜健康安全的隐患。我国主要的农药市场仍然是化学农药市场，但生物农药的利润增长率已有超过化学农药的趋势[17]。利用植物次生代谢产物开发生物农药具有低毒、环保、高效的优点，已经得到广泛的重视。

为了充分开发利用木姜子资源，采用水蒸气蒸馏法提取木姜子果实的挥发油（LPO），采用GCMS分析其化学成分，并测定其对果生刺盘孢菌和尖孢镰刀菌的抑菌活性，以期为木姜子挥发油作为生物农药和食品保鲜剂的开发提供参考。

1 研究方法

1.1 实验材料

材料：2019年9月在四川省洪雅县采集成熟、完好的木姜子鲜果，清洗后阴干备用。

菌种：果生刺盘孢菌和尖孢镰刀菌由四川农业大学植物学实验室培养提供。

无水硫酸钠为市售分析纯，吐温-20为市售化学纯（均购于成都科隆化工试剂厂）。

1.2 实验设计

（1）挥发油提取

将新鲜木姜子果实阴干后磨成细粉，用水蒸气蒸馏法[18]提取6 h。静置和分层后，添加无水硫酸钠以去除水分，所获得的精油在4°C下储存于棕色瓶中。按以下公式计算精油的提取率：

（2）GC-MS分析

精油用正己烷稀释至10 μL·mL-1，并用正己烷作为空白对照。

气相色谱条件:分析柱：HP-5MS柱子；升温程序：设定初始温度为60°C， 保持6 min，以12°C·min-1升温速度升至100°C，保持5 min；以10°C·min-1升至160°C，保持5 min；再以12°C·min-1升至280°C保持5 min。载气为氦气，进样量：1 μL，分流50∶1，进样口温度为260°C，接口温度220°C。

质谱条件：电子轰击（EI）离子源，电子能量70 eV，电子倍增器电压1.5 KV，质量扫描范围40~550 amu，全扫描，进样量1 μL。

数据处理及质谱检索：通过气相色谱-质谱联用仪提供的 NIST MS 质谱数据库进行分析确定其组成成分, 并通过峰面积归一化法计算各成分的相对含量。

（3）抑菌试验

选择菌丝生长速率法[19]，将已经配置好的PDA培养基融化，等待其温度降低至40-50°C时，将挥发油用适量的吐温-80配置成50 mg·mL-1，再与PDA培养基混匀稀释成系列浓度，使其最终浓度为2.5、3.75、5、7.5、10、15和20 mg·mL-1，混合后倒板，等待其凝固后，将已活化的两种病原菌的菌饼（直径为6 cm）接入培养基，各浓度进行重复3次接种，以普通PDA培养基作为空白对照组（CK），以加入吐温-80的板为阴性对照组，放置于28°C恒温培养箱中培养6 d。以48 h为起始点，每隔24 h观察记录1次，用十字交叉法测量菌落直径（mm），计算出3次的平均值，将所得的数据通过以下公式计算菌丝生长抑制率。

2 结果与分析

2.1 木姜子挥发油的成分分析

SD法提取的木姜子挥发油（LPO）得率为1.6%（v/w），密度为0.89g·mL-1。对木姜子挥发油进行GC-MS分析，总离子流色谱图见图1。对各峰质谱图进行NIST标准谱库检索，参考标准图谱和相关文献确定化学结构，利用峰面积归一化法计算各组分的相对含量。由表1可知，木姜子挥发油中共鉴定出19个成分，主要是单萜类、倍半萜类及其含氧衍生物。其中含量最高的是柠檬烯（29.20%）、柠檬醛（30.10%）、芳樟醇（6.45）和桉叶素（5.65%）等单萜烯类和单萜类物质。

2.2 木姜子挥发油的抑菌活性

木姜子挥发油对果生刺盘孢菌和尖孢镰刀菌的抑菌效果见图2。结果表明，在20 mg·mL-1时，96 h以内木姜子挥发油对两种真菌具有100%的抑菌效果，随着浓度降低和时间增加，抑菌效果逐渐下降。48 h内对尖孢镰刀菌的抑菌效果强于对果生刺盘孢菌。72 h后，在高浓度时（10~20 mg·mL-1）时对尖孢镰刀菌的抑菌效果更好，在低浓度（2.5~7.5 mg·mL-1）时对果生刺盘孢菌的抑菌效果更好。可见木姜子挥发油对2种病原菌均有良好的抑菌效果。

3 结论与讨论

采用水蒸气蒸馏法提取洪雅产木姜子鲜果的挥发油，发现其富含单萜类化合物（46.98%）和单萜烯类化合物（42.32%），主要以柠檬烯、柠檬醛和芳樟醇为代表。根据Jiang[8]的研究表明，木姜子的挥发油以单萜类和倍半萜类成分含量最高。这和我们的研究结果有所差异，可能是由于品种、生长环境或者生长年份和收获季节的不同造成的。

图1 GC-MS总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram （TIC） of GC-MS

表1 木姜子挥发油化学成分分析Tab.1 Chemical composition of LPO

通过菌丝生长速率法测试LPO对果生刺盘孢菌和尖孢镰刀菌的抑菌活性发现，发现LPO对2种病原真菌均有良好的抑菌活性，并表现出明显的剂量效应，随着时间延长和浓度减少，抑菌效果逐渐降低。挥发油的抑菌效果一般认为是多种成分的协同作用。，随着时间延长和浓度减少，抑菌效果逐渐降低。挥发油的抑菌效果一般认为是多种成分的协同作用。LPO的主成分柠檬醛（30.10%）、柠檬烯（29.20%）、芳樟醇（6.45）、桉叶素（5.65%）、α-蒎烯（4.06%）和β-蒎烯（3.08%）都被报道过抑菌活性。Chang等人发现柠檬烯、α和β-蒎烯对腐皮镰孢菌和尖孢镰刀菌具有杀菌活性[20]。柠檬醛被报道具有抑制黄曲霉的效果[21]。王雪等发现柠檬醛和芳樟醇与抑菌性有显著正相关关系[13]。芳樟醇气相处理可改变大肠杆菌生物膜蛋白结构和脂肪酸组成[22]。但在预实验中采用柠檬醛单体测试抑菌活性时却发现对这2种病原菌并无显著抑菌效果。因此，推测LPO的抗真菌活性和柠檬烯、芳樟醇、蒎烯等主成分的协同作用有关。但对于具体的抑菌成分和抑菌机理还需进一步研究。木姜子挥发油具有药用和食用功效，其显著的抑菌活性有助于被作为生物农药和食品保鲜剂进行深入研究和开发。