急性支气管哮喘病人外周血程序性死亡因子-1及其配体的表达

钱美芳，张艳，尤倩，赵薇

支气管哮喘是世界范围内最常见的慢性疾病之一，其发病率每年增加，已成为全球公共卫生问题，严重影响病人生命健康和生活质量［1］。支气管哮喘的发病机制非常复杂，目前研究认为其发病机制有气道高反应性、免疫变态反应、气道炎症等［2-3］。研究表明，CD4+T淋巴细胞作为关键的淋巴细胞，参与哮喘的免疫过程，其分化的T辅助细胞失衡已被认为是哮喘发病的经典免疫理论，但其无法完全解释哮喘发病机制［4］。程序性死亡因子-1（programmed death factor-1，PD-1）及 其 配 体（programmed death ligand-1，PD-L1）是近年来发现的负性协同刺激分子，是多种免疫反应的关键调节因子，在自身免疫和自身耐受以及癌症免疫学中发挥关键作用，PD-1/PD-L1通路已成为免疫治疗的新靶点［5］。目前PD-1/PD-L1表达与急性支气管哮喘发病及病情严重程度的关系尚不十分明确，本研究通过检测急性支气管哮喘病人外周血CD4+T淋巴细胞中PD-1（CD4+PD-1）、CD8+T淋 巴 细 胞 中PD-1（CD8+PD-1）、CD19+B淋巴细胞中PD-L1（CD19+PD-L1）的表达，分析其与疾病严重程度的关系，并探讨其在支气管哮喘发生及发展中的作用，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料本研究采用前瞻性研究的方法，选择2017年2月至2019年3月无锡市第五人民医院收治的101例急性支气管哮喘病人作为病例组研究对象，其中男58例，女43例，年龄范围21～48岁，年龄（34.56±10.29）岁。纳入标准：（1）符合《支气管哮喘防治指南（2016）版》中哮喘诊断标准，表现为喘息、气急等症状突发或加重，呼气流量降低等急性发作特征［6］；（2）自愿加入研究，能配合研究。排除标准：（1）慢性持续性哮喘者；（2）慢性阻塞性肺疾病、变态反应性肺浸润及气管、主支气管肺癌者；（3）左心衰竭等其他原因引起的喘息样呼吸困难者；（4）合并类风湿性关节炎、慢性肝病、皮肤病等其他免疫性疾病者；（5）近期内接受过免疫治疗者；（6）临床病理资料缺失者。另选择同时期体检健康且无个人或家族过敏史或哮喘史的40例为对照组，男23例，女17例，年龄范围25～55岁，年龄（38.11±12.54）岁。两组性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义（P＜0.05），具有可比性。本研究获无锡市第五人民医院伦理委员会批准（批号为无锡五院论文伦字第2020-017-1），病人及其近亲属知晓研究方案并签署知情同意书。

1.2 分组根据哮喘急性发作期病情严重程度［6］，其中轻中度46例（轻中度组），重度34例（重度组），危重21例（危重组）。轻中度组男26例、女20例，年龄范围21～47岁、年龄（33.90±10.02）岁；重度组男19例、女15例，年龄范围21～48岁、年龄（34.71±10.38）岁；危重组男13例、女8例，年龄范围22～48岁、年龄（35.14±10.55）岁。三组性别、年龄相比差异无统计学意义（P＜0.05），具有可比性。

1.3 研究方法①采集急性支气管哮喘病人入院时及对照组健康体检时肘静脉血5 mL，取3 mL加入乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，用于检测外周血CD4+PD-1、CD8+PD-1、CD19+PD-L1表达水平；另2 mL室温静置30 min，1 600 r/min离心5 min，提取上清，用于检测白细胞介素4（interleukin-4，IL-4）、白细胞介素17（interleukin-17，IL-17）水平。②取50 μL血液分装至新的无菌试管，分别加入CD4-异硫氰酸荧光素（FITC）、CD8-FITC，CD19-FITC、PD-1抗体、PD-L1抗体，避光震荡混匀30 min，按1∶5比例向各试管中加入溶血剂，40～50℃恒温下震荡至溶液透明亮（红细胞溶解），1 600 r/min离心5 min，弃上清，加入磷酸缓冲盐溶液（PBS）冲洗2次，避光下加入含1%多聚甲醛的PBS溶液固定，FACS Calibur流式细胞仪（美国BD公司）检测外周血CD4+PD-1、CD8+PD-1、CD19+PD-L1表达水平，FlowJo软件分析数据，并计算PD-1/PD-L1值。实验用抗体购于上海优宁维生物科技股份有限公司。③采用瑞士艾科EcoMedics化学发光分析仪（瑞士ECO公司）检测受试者呼出气一氧化氮（fractional exhaled nitric oxide，FeNO）水平。④采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测外周血IL-4、IL-17水平，人IL-4 ELISA、人IL-17 ELISA检测试剂盒购于上海晶抗生物工程有限公司，实验方法严格参照试剂说明书进行。

1.4 观察指标①比较对照组和病例组外周血CD4+PD-1、CD8+PD-1、CD19+PD-L1表 达 水 平 及PD-1/PD-L1值。②比较对照组和病例组FeNO及外周血IL-4、IL-17水平。③比较病例组病人不同病情严重程度外周血CD4+PD-1、CD8+PD-1、CD19+PDL1表达水平及PD-1/PD-L1值。④比较病例组病人外周血PD-1/PD-L1表达水平与FeNO、IL-4、IL-17水平的关系。

1.5 统计学方法应用SPSS 22.0进行统计分析。计量资料均符合正态分布，以表示，两组间比较采用独立样本t检验，三组间比较采用单因素方差分析，多组有统计学差异时以LSD-t检验进行两两比较|；采用Pearson相关系数分析外周血PD-1/PD-L1表达水平与FeNO、IL-4、IL-17水平的相关性。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组外周血中PD-1/PD-L1表达水平病例组外周血CD4+PD-1表达水平高于对照组（P＜0.05）；两组外周血CD8+PD-1表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）；病例组外周血CD19+PD-L1表达水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；病例组外周血PD-1/PD-L1比值高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 体检健康者40例与急性支气管哮喘101例外周血中PD-1/PD-L1表达水平比较/

表1 体检健康者40例与急性支气管哮喘101例外周血中PD-1/PD-L1表达水平比较/

注：PD-1为程序性死亡因子-1，PD-L1为程序性死亡因子-1配体，CD4+PD-1为CD4+T淋巴细胞中PD-1，CD8+PD-1为CD8+T淋巴细胞中PD-1，CD19+PD-L1为CD19+B淋巴细胞中PD-L1。

组别对照组病例组t值P值例数 4 0 101 CD4+PD-1 5.43±1.52 17.98±4.16 18.56＜0.001 CD8+PD-1 3.06±0.98 3.75±1.12 0.45 0.657 CD19+PD-L1 1.08±0.27 3.13±0.75 16.83＜0.001 PD-1/PD-L1（CD4+PD-1/CD19+PD-L1）5.03±1.11 5.75±1.62 2.58 0.011

2.2 两组FeNO及外周血IL-4、IL-17水平病例组FeNO水平高于对照组，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；病例组外周血IL-4水平低于对照组，IL-17水平高于对照组，两组比较均差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 体检健康者40例与急性支气管哮喘101例FeNO及外周血IL-4、IL-17水平比较/

表2 体检健康者40例与急性支气管哮喘101例FeNO及外周血IL-4、IL-17水平比较/

注：FeNO为呼出气一氧化氮，IL-4为白细胞介素4，IL-17为白细胞介素17。

组别对照组病例组t值P值例数40 101 FeNO/（μg/L）16.38±4.12 29.74±6.08 12.77＜0.001 IL-4/（ng/L）12.86±3.65 9.14±2.47 6.99＜0.001 IL-17/（ng/L）24.73±5.21 38.66±8.27 9.89＜0.001

2.3 病例组不同严重程度外周血PD-1/PD-L1表达水平危重组外周血CD4+PD-1表达水平均高于重度组和轻中度组，差异有统计学意义（P＜0.05）；重度组外周血CD4+PD-1表达水平高于轻中度组，差异有统计学意义（P＜0.05）；三组外周血CD8+PD-1表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）；危重组外周血CD19+PD-L1表达水平高于重度组和轻中度组，差异有统计学意义（P＜0.05），重度组外周血CD19+PD-L1表达水平高于轻中度组，差异有统计学意义（P＜0.05）；危重组和重度组PD-1/PD-L1比值高于轻中度组，差异有统计学意义（P＜0.05），危重组和重度组间PD-1/PD-L1比值比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 不同严重程度急性支气管哮喘101例外周血PD-1/PD-L1表达水平/

表3 不同严重程度急性支气管哮喘101例外周血PD-1/PD-L1表达水平/

注：PD-1为程序性死亡因子-1，PD-L1为程序性死亡因子-1配体，CD4+PD-1为CD4+T淋巴细胞中PD-1，CD8+PD-1为CD8+T淋巴细胞中PD-1，CD19+PD-L1为CD19+B淋巴细胞中PD-L1。①与轻中度组比较，P＜0.05。②与重度组比较，P＜0.05。

组别轻中度组重度组危重组F值P值例数 4 6 34 21 CD4+PD-1 16.54±3.11 18.17±3.84①20.83±4.02①②10.52＜0.001 CD8+PD-1 3.63±0.87 3.81±0.95 3.92±1.06 0.79 0.457 CD19+PD-L1 2.93±0.46 3.12±0.32①3.58±0.57①②15.40＜0.001 PD-1/PD-L1（CD4+PD-1/CD19+PD-L1）5.64±0.24 5.82±0.31①5.81±0.22①5.67 0.005

2.4 病例组外周血PD-1/PD-L1表达水平与Fe-NO、IL-4、IL-17水平的关系病例组外周血CD4+PD-1表达水平与FeNO呈正相关关系（r=0.61，P＜0.001），与IL-4呈负相关关系（r=-0.43，P=0.024），与IL-17呈 正 相 关 关 系（r=0.51，P=0.019）；外 周 血CD19+PD-L1表达水平与FeNO呈正相关关系（r=0.55，P=0.015），与IL-4呈负相关关系（r=-0.38，P=0.037），与IL-17呈正相关关系（r=0.50，P=0.021）。见图1。

图1 病例组外周血PD-1/PD-L1表达水平与呼出气一氧化氮（FeNO）、白细胞介素（IL）-4、IL-17水平的相关性

3 讨论

PD-1及其配体PD-L1属于CD28/B7蛋白家族成员，参与T淋巴细胞共刺激信号传递，并作为调节T细胞免疫应答和T细胞介导外周免疫耐受的关键因素［7］。已有研究表明，PD-1/PD-L1信号通路与系统性红斑狼疮、肝炎、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病密切相关［8-10］。因此，PD-1/PD-L1信号通路已成为研究自身免疫性疾病发病机制及靶向治疗的新途径。本研究结果，与健康者相比，急性支气管哮喘病人外周血CD4+PD-1表达水平升高，CD19+PD-L1表达水平升高，且PD-1/PD-L1比值高于健康者。观察PD-1/PD-L1在不同病情严重程度病人中的表达发现，随病情严重程度增加，外周血PD-1/PD-L1呈升高趋势。说明外周血PD-1/PD-L1表达与急性支气管哮喘病人病情严重程度有关，病情越严重，外周血PD-1/PD-L1表达可能越高。与PD-1/PD-L1介导抑制T细胞活化增殖，诱导保护性免疫等负性免疫调节作用理论相反［11］，支气管哮喘病人外周PD-1/PD-L1表达升高似乎并未控制病情发展。PD-1/PD-L1在支气管哮喘中的作用可能存在多样性。

辅助性T细胞2（helper T cell 2，Th2）/辅助性T细胞（helper T cell 17，Th17）间的平衡是哮喘发病重要免疫机制，Mcalees等［12］以过敏性哮喘小鼠模型为对象，PD-1/PD-L1对不同CD4+T细胞亚群具有不同影响，阻断PD-1/PD-L1可通过促进Th17细胞型免疫应答而增强气道高反应性，证实PD-1/PDL轴通过抑制Th17细胞活性而控制哮喘严重程度，提示严重过敏性哮喘可能与PD-1/PD-L1调节轴缺失有关。此外，Th17和调节性T细胞（Regulatory cells，Treg）间的平衡是哮喘发病机制的新模式，Xi等［13］研究表明，哮喘病人Treg细胞中PD-1表达明显高于Th17细胞中PD-1表达，而PD-L1表达明显低于Th17细胞中PD-L1表达，体外给予抗PD-1可降低哮喘病儿CD4+T细胞中Th17细胞，而增加Treg细胞百分比，提示抗PD-1治疗对哮喘模型具有保护作用。说明PD-1/PD-L1在不同T淋巴细胞具有不同调节作用。本研究相关性分析显示，急性支气管哮喘病人外周血PD-1/PD-L1表达与FeNO、IL-17呈正相关关系，与IL-4呈负相关关系。FeNO作为评估气道炎症和哮喘控制水平的指标，反映病人气道炎症水平和哮喘严重程度［14］。IL-4是由Th2分泌的免疫因子，对T细胞、B细胞、巨噬细胞等都有免疫调节作用，而IL-17由Th17分泌为促炎因子，反映机体炎症水平［15-16］。说明急性支气管哮喘病人外周血PD-1/PD-L1表达与气道炎症和病情严重程度有关，推测PD-1/PD-L1过高表达可能通过扰乱Th2/Th17、Th17/Treg细胞之间的平衡介导免疫反应，与张宏宇等［17］在自身免疫性肝炎中的研究结果相似。

目前尚无完全治愈支气管哮喘的药物，特异性免疫治疗是世界卫生组织推荐的唯一针对支气管哮喘病因的治疗方法［18］。临床研究表明，特异性免疫治疗能够有效改善病人临床症状、减少药物使用量及改善敏感状态［19］。因此，发现哮喘病人T淋巴细胞亚群失衡的调控机制，有助于靶向治疗提高临床疗效。

综上所述，急性支气管哮喘病人外周血T淋巴细胞中PD-1/PD-L1异常表达，可能通过扰乱Th2、Th17、Treg等细胞平衡，调节病人免疫状态，与病人病情严重程度密切相关。但由于PD-1/PD-L1表达的广泛性及其在免疫反应调节中的复杂性，其对急性支气管哮喘严重程度的预测价值及临床治疗价值仍需进一步深入探究。