舟山市城区内河道地表水菌株分离与鉴定

王开扬郑刚 杨志坚肖金星苗周迪干满水

(1.浙江大学 舟山海洋研究中心，浙江 舟山 316100；2.舟山市生态环境局定海分局，浙江 舟山 316100)

舟山市是我国养殖业和国际贸易重点区域，随着我国现代化的推进，工业生产所带来的工业废水排放量逐渐增加。这些工业废水不经处理即被排放至舟山市周遭的地表水内，从而使得地表水污染越来越严重[1-2]。据统计，舟山市工业废水和生活污水排放总量占全市废水总排放量的50.6%，这表明人类生产生活所产生的工业及生活污水成为舟山市市域地表水的主要污染源[3]。现阶段舟山市主要地表污染表现为有机污染物、氮和磷等的污染负荷较高，整体水质呈劣V类状况，且在少雨季节，城区河道出现发黑、发臭现象[4]。因此对舟山市周遭地表水进行污染治理刻不容缓。

微生物循环驯化系统是一种基于污染水体中原有的有机物、营养盐作为营养组分，结合培养工艺，将高效益生菌种进行驯化培养的地表水处理工艺[5]。该方法的特点是可以将外源益生菌与土著微生物相结合，在不破坏土著微生物的自然生态条件的情况下，有效地提高水体自净能力并恢复受污染水体的水生态系统[6-7]。相较于传统微生物和地表水治理技术，该处理工艺具有治污效率高、水质维护范围广、除污能力强和维护成本低等特点，更适用于城市周遭地表水环境的治理[8]。使用该工艺治理地表水时，需先全面了解受污染区域的土著微生物分布情况，并针对其区域菌种特性进行工艺调整，以达到最优的处理效果[9-10]。

本文以舟山市的城关河、城西河、洋岙河、庆丰河、蓬莱河、环南河、解放河、盛家塘等8处河道为研究采样对象，使用牛肉膏蛋白胨固体平板培养基的平板涂布法，对样品分离纯化，再结合基因测序对菌株进行基因分析，研究对象中微生物的组成情况，以期为舟山市周遭河道治理提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验耗材

实验所用牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、氢氧化钠、琼脂、盐酸均采购于上海沪试试剂有限公司，纯度均为优级纯。

1.2 实验仪器

基因测序仪(ABI3730，美国赛默飞科技有限公司)、恒温培养箱(302A，常州市凯航仪器有限公司)、高压灭菌锅(LDZM-40KCS-II，广州瑞丰设备仪器有限公司)、精密电子天平(FA-E型，常州市幸运电子设备有限公司)、pH计(pHS-1，优莱博技术(北京)有限公司)、玻璃器皿若干。

1.3 实验方法

1.3.1 实验准备

实验前期准备主要包括玻璃器皿的洗涤、灭菌和培养基的制备分装工作。其中玻璃器皿的洗涤主要先使用纯水浸泡，随后配合毛刷和清洗剂清洗玻璃器皿上的顽固污渍，最后将洗涤干净的玻璃器皿置于烘箱中烘干。玻璃器皿的灭菌工作是用加压蒸汽灭菌法进行灭菌，将清洗过后的玻璃器皿置于灭菌锅内，在120℃条件下灭菌30min，灭菌结束后置于恒温烘箱中烘干备用。培养基的制备工作如下：将0.5g牛肉膏、1g蛋白胨、2g琼脂和0.5g氯化钠置于100mL的灭菌水中，加热搅拌均匀后，使用氢氧化钠或盐酸调节培养基pH值。待培养基冷却至60℃时，制作斜面平板培养基。

1.3.2 样品采集

实验取采样水域的水面下10—15cm的深层水样，将带盖的灭菌玻璃瓶瓶口向下置于水中，再将瓶口朝正取出玻璃塞，待样品灌满取样瓶后再盖上玻璃塞，并及时避光冷藏保存，带回实验室后立即进行实验分析。

1.3.3 样品分离及培养

实验使用平板表面涂布法处理待测样品，实验用先取1mL待测样品置于预先装好9mL无菌水的样品管中，再摇匀并重复数次，可得浓度为10-6的菌液。随后吸取一定量稀释过的菌液置于预先制备好的牛肉膏蛋白胨培养基培养平板上，再使用三角刮刀在平板上涂抹均匀，最后将培养基置于37℃的恒温烘箱中培养。待菌落长出后，将长出的菌株重复分离，直至获得纯菌。

1.4 菌株分析

1.4.1 初步分析

由于各个菌株在培养中生长情况有差异，需要基于其菌落形状、大小、结构、高度、气味、颜色、透明度及质地来初步分析菌株的类型。

1.4.2 基因测序分析

取1.0 μL的待分析样，加入9.0 μL的Formamide deionized(Amresco公司)，在95 ℃条件下变性3min后立即冰水浴5min，随后在基因测序仪上进行基因片段分析，使用自带软件对待测物的基因片段大小、峰图颜色和突变位置进行分析，以确定待测物的菌落种类。

2 结果与讨论

2.1 菌株统计

2.1.1 城关河菌株统计

城关河地表水样品中分离可得10种菌株，其中包括细菌菌株BS0200(1-1)、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)TPS3N(1-2)、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)EGY-SCJ5(1-3)、油菜科假单胞菌(Pseudomonasoleovorans)B21(1-4)、门多萨假单胞菌(Pseudomonasmendocina)ATCC 25411(1-5)、中山井芽孢杆菌(Bacillusnakamurai)NRRL B-41091(1-6)、苍白杆菌(Ochrobactrumanthropi)ATCC 49188(1-7)、金黄杆菌(Chryseobacteriumcucumeris)GSE06(1-8)、金路德维希肠杆菌(Enterobacterludwigii)EN-119(1-9)和阿氏芽孢杆菌(Bacillusaryabhattai)B8W22(1-10)，各菌株分析相似度如图1所示。由图1可知，整体菌株分析结果相似度都在98.5%以上，表明样品分离纯化结果和样品分析结果良好。

图1 城关河菌株分析相似度

2.1.2 城西河菌株统计

城西河地表水样品中分离可得7种菌株，其中包括三价砷氧化细菌(Acidovoraxsp.)R022(2-1)、波希不动杆菌(Acinetobacterbrisouii)5YN5-8(2-2)、金黄杆菌(Chryseobacteriumlineare)XC0022(2-3)、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)FZB42(2-4)、鞘氨醇盒菌属(Sphingopyxissolisilvae)R36698(2-5)、德氏食酸菌(Acidovoraxdelafieldii)133(2-6)、黄杆菌属(Flavobacteriumnotoginsengisoli)SYP-B540(2-7)，各菌株分析相似度如图2所示。其中除(Sphingopyxissolisilvae)R36698(2-5)相似度低于98%外，其他菌株相似度均高于98%，表明结果可信度较高。

图2 城西河菌株分析相似度

2.1.3 洋岙河菌株统计

洋岙河地表水样品中分离可得7种菌株，其中包括杰氏棒杆菌(Chryseobacteriumaquaticum)10-46(3-1)、贪噬菌属(Variovoraxparadoxusstrain)S004b(3-2)、寡养单胞菌(Stenotrophomonassp.strain)47(3-3)、假单胞菌属(Pseudomonassp.)P41(3-4)、固氮螺菌(Azospirillumsp.)BPM34(3-5)、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)FZB42(3-6)、三价砷氧化细菌(Acidovoraxsp.)R022(3-7)，各菌株分析相似度如图3所示。由实验结果可知，各菌株分析结果可信度均高于98.5%。

图3 洋岙河菌株分析相似度

2.1.4 庆丰河菌株统计

庆丰河地表水样品中分离可得3种菌株，其中包括假单胞菌属(Pseudomonasoleovoranssubsp.)LPB0305(4-1)、未培养的细菌克隆(Unculturedbacteriumclone)2-57(4-2)和三价砷氧化细菌(Acidovoraxsp.)R022(4-3)，各菌株分析相似度如图4所示。

图4 庆丰河菌株分析相似度

2.1.5 蓬莱河菌株统计

蓬莱河地表水样品中分离可得5种菌株，其中包括根瘤菌(Rhizobiumrosettiformansstrain)S1(5-1)、未培养的γ蛋白杆菌基因(Unculturedgammaproteobacteriumgene)(5-2)、杆菌属(Bacteriumstrain)BS0660(5-3)、假单胞菌(Pseudomonasputidastrain)Xuyi_350_2(5-4)、苍白杆菌属(Ochrobactrumsp.strain)JZ28(5-5)，各菌株分析相似度如图5所示。

图5 蓬莱河菌株分析相似度

2.1.6 环南河菌株统计

环南河地表水样品中分离可得6种菌株，其中包括寡养单胞菌(Stenotrophomonassp.strain)SNH_K97(6-1)、假单胞菌(Pseudomonassolistrain)CAU 1560(6-2)、无色菌(Achromobactermucicolensstrain)LZU-1(6-3)、寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophiliastrain)Xuyi_402_1(6-4)、苍白杆菌属(Ochrobactrumsp.strain)P6(6-5)、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)FZB42(6-6)，各菌株分析相似度如图6所示。

图6 环南河菌株分析相似度

2.1.7 解放河菌株统计

解放河地表水样品中分离可得5种菌株，其中包括假单胞菌(Pseudomonassp.strain)KUDC6083(7-1)、寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophiliastrain)PRNB7(7-2)、中华根瘤菌(Sinorhizobiumsp.strain)CK-23(7-3)、剑菌属(Ensiferadhaerensstrain)NK22(7-4)、根瘤菌(Rhizobiumsp.strain)HPB5(7-5)，各菌株分析相似度如图7所示。

图7 解放河菌株分析相似度

2.1.8 盛家塘菌株统计

盛家塘地表水样品中分离可得4种菌株，其中包括假单胞菌(Pseudomonasmosseliistrain)yy161(8-1)、假单胞菌(Pseudomonasputidastrain)DSS-CAP-4(8-2)和根瘤菌(Rhizobiumsp.strain)SCAU410(8-3)和寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophiliastrain)SJTL3(8-4)，各菌株分析相似度如图8所示。

图8 盛家塘菌株分析相似度

2.2 典型菌株特征

筛选各河流区域的典型菌株从直径、颜色、边缘、是否凸起、干湿程度、透明程度及革兰氏染色结果并结合仪器分析相似度进行菌落种类分析。

2.2.1 菌株1-8特征分析

菌株分离培养图如图9-1a、9-1b所示，菌落直径约0.8 mm，颜色呈金黄色，边缘整齐，凸起，菌落干燥，不透明，革兰氏染色呈阴性。该特征与基因测序分析所得的金黄杆菌菌落特征一致，可推断菌株为金黄杆菌(Chryseobacteriumcucumerissp.strain)(1-8)。

图9-1 菌株培养基及革兰氏染色(左a、右b)

2.2.2 菌株2-1特征分析

菌株分离培养图如图9-2a、9-2b所示，菌落直径约0.3 mm，颜色呈白色，边缘整齐，凸起，菌落湿润，不透明，革兰氏染色呈阴性。该特征与基因测序分析所得的三价砷氧化细菌特征一致，可推断菌株为三价砷氧化细菌(Acidovoraxsp.strain)(2-1)。

图9-2 菌株培养基及革兰氏染色(左a、右b)

2.2.3 菌株3-3特征分析

菌株分离培养图如图9-3a、9-3b所示，菌落直径约0.5mm，白色，边缘整齐，凸起，湿润，不透明；在显微镜下细胞呈椭圆形，细胞单个、成对或成链，革兰氏染色呈阳性。该特征与基因测序分析所得的寡养单胞菌菌株特征一致，可推断该菌株为寡养单胞菌菌株(Stenotrophomonassp.strain)(3-3)。

图9-3 菌株培养基及革兰氏染色(左a、右b)

2.2.4 菌株3-4特征分析

菌株分离培养图如图9-4a、9-4b所示，菌落直径约4mm，白色，边缘整齐，凸起，湿润，不透明；在显微镜下细胞呈椭圆形，细胞单个、成对或成链，革兰氏染色阳性。该特征与基因测序分析所得的假单胞菌属(Pseudomonassp.)P41特征一致，可推断该菌株为假单胞菌属(Pseudomonassp.)P41。

图9-4 菌株培养基及革兰氏染色(左a、右b)

2.2.5 菌株5-5特征分析

菌株分离培养图如图9-5a、9-5b所示，菌落直径约2mm，浅白色，边缘整齐，凸起，湿润，不透明；在显微镜下细胞呈棒槌形，中间略窄，单个、成对或成链，革兰氏染色呈阳性。该特征与基因测序分析所得的苍白杆菌属菌株特征一致，可推断该菌株为苍白杆菌属(Ochrobactrumsp.strain)JZ28。

图9-5 菌株培养基及革兰氏染色(左a、右b)

2.2.6 菌株8-3特征分析

菌株分离培养图如图9-6a、9-6b所示，菌落直径约6mm，浅白色，边缘呈发散毛刺状，凸起，干燥，不透明；在显微镜下细胞呈圆形，整体呈“T”形，革兰氏染色结果为阳性。该特征与基因测序分析所得的根瘤菌菌株特征一致，可推断该菌株为根瘤菌(Rhizobiumsp.strain)SCAU410。

图9-6 菌株培养基及革兰氏染色(左a、右b)

3 结语

本研究基于牛肉膏蛋白胨固体平板培养基的平板涂布法对城关河、城西河、洋岙河、庆丰河、蓬莱河、环南河、解放河、盛家塘等8处河道的菌株进行分离提纯，再结合ABI3730基因测序仪对其特征基因段进行分析，以研究各河道菌株主要分布及组成。由实验结果可知，城关河、城西河、洋岙河、庆丰河、蓬莱河、环南河、解放河、盛家塘等8处河道中各分离出10、7、7、3、5、6、5、4种菌株，合计共47种菌株，其中共有6种特征菌株，其基因测序结果分别为金黄杆菌(Chryseobacteriumcucumerissp.strain)(1-8)、三价砷氧化细菌(Acidovoraxsp.strain)(2-1)、寡养单胞菌(Stenotrophomonassp.strain)(3-3)、假单胞菌(Pseudomonassp.strain)P41(3-4)、苍白杆菌(Ochrobactrumsp.strain)JZ28(5-5)、根瘤菌(Rhizobiumsp.strain)SCAU410(8-3)，其中各典型菌株的菌落特征、细菌形貌及革兰氏染色结果与各细菌特征一致。此实验结果可作为舟山市周遭河道治理的实验依据。