低磷胁迫下内生真菌对台湾相思叶绿素荧光特性的影响

何晨阳，陈 珑，王耘籽，周艳芬，李 键，吴承祯,2，洪 滔*

(1.福建农林大学林学院，福建省高校森林生态系统过程与经营重点实验室，福建 福州 350002；2.武夷学院生态与资源工程学院，福建 南平 354300)

磷元素是植物生命过程中重要的营养元素之一，其通过参与植物体各部分的生理过程，调控植物的光合作用[1]，在碳水化合物、含氮化合物、脂肪、糖类的代谢[2-4]过程中对植物的信号传导起关键作用，对植物的生长发育、抗逆性有着重要影响[5].现有研究表明磷素的匮乏会导致植物叶片中总氮含量和可溶性蛋白含量下降，叶片中色素缺乏，叶绿体结构发生改变[6]，引起潜在的光氧应激反应，导致叶绿体中活性氧浓度增加，损害植物的脂质、蛋白质和核酸，造成不可逆转的伤害[7].人工林因密度种植和连栽[8]，对土壤有效磷含量需求极大[9]，而我国南方林区普遍存在土壤磷素矿化现象，磷素难以被有效利用[10]，极大地限制了人工林光合效率的提高，制约着人工林的可持续经营.

台湾相思(Acaciaconfusa)为含羞草科金合欢属常绿乔木，产于中国台湾，广泛分布在福建、广东等地区，因其具有生长快、耐贫瘠、适应性强的特点，已取代连栽后防护效益下降的木麻黄林，逐步成为东南沿海地区海岸防护林的重要改造树种[11].现有研究表明，台湾相思为磷素受限树种[12]，栽植台湾相思的沙迹地土壤磷素匮乏[13].因此，如何在低磷条件下提高台湾相思对有效磷的利用效率，以促进其在沿海防护林体系建设中的应用极为重要.

为改善林木应对低磷环境的胁迫，前人已从植物根系形态[14]及根系分泌物[15]、植物生长及生理生化特性[16]等方面做了大量研究，虽取得一定成效，但囿于成本或生境复杂，目前还未形成低成本的高效方法.因此，近年来利用微生物与植物互利共生特性来提升植物的环境适应性已成为研究热点，在杉木筛选及其适应磷胁迫的离子流机制[17]、丛枝菌根真菌和根际细菌群落的跨界互作网络[18]、不同混播方式的燕麦(Avenasativa)与箭筈豌豆(Viciasativa)混植草地对磷利用效率的影响[19]的研究中，已成功利用微生物提升了磷的利用效率.前人发现利用植物内生真菌能有效提升尾巨桉(E.urophylla×E.grandis)、黑麦草(Loliumperenne)和杉木(Cunninghamialanceolata)的光合作用效率[20-22]，但对台湾相思是否存在与其内生真菌有互利共生特性，及其对提升植物光合适应性的作用，目前尚未见报道.因此，本研究在前期筛选台湾相思内生真菌[11]的基础上，通过磷胁迫方式分析台湾相思的光合作用相关指标变化，以解析低磷条件下内生真菌对台湾相思叶绿素荧光特性的影响，初步了解内生真菌与宿主台湾相思协同应对磷素胁迫的生理机制，以期为台湾相思促生工程菌的开发提供参考，亦为东南沿海海岸防护林可持续改造提供基础依据.

1 材料与方法

1.1 材 料

试验用苗为一年生台湾相思幼苗(福建漳州林业局提供)，苗木采用土培方式定植于塑料盆(高20 cm、直径21 cm)，每盆装3 kg黄壤(土壤类别为二类)，等量甲醛熏蒸消毒，定植后缓苗30 d.土壤化学性质经测定，含有机质8.311 mg/g、全氮0.107 mg/g、水解氮0.035 mg/g、全磷0.353 mg/g、有效磷0.019 mg/g、全钾2.889 mg/g、速效钾0.025 mg/g.

试验菌株为前期从台湾相思中筛选并鉴定的溶磷效果较好的4株内生真菌[11]：丝黑粉菌属F (Filobasidiumsp.)、青霉属I (Penicilliumsp.)、青霉属E (Penicilliumsp.)、青霉属N (Penicilliumsp.).因预试验中菌株F与I产生较大溶磷圈，故设置菌株FI混合菌组，进一步验证优势菌株结合的溶磷效果.菌种均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，F、I、E、N菌种保藏号分别为CGMCC 12102、CGMCC 11914、CGMCC 11913、CGMCC 11907.

1.2 实验设计

1.2.1 菌液制备与接种

将供试菌种F、I、E、N分别接入40 mL的菌液培养基，恒温振荡培养箱中培养48 h，采用血球计数法，用无菌水稀释成密度为5.5×106mL-1的菌液.FI菌液由F菌液与I菌液按质量比1∶1混合制得.连续3 d 在苗木根际施加100 mL上述菌液，以加入同体积灭活的稀释培养基溶液为对照(CK)，共F、I、E、N、FI、CK 6个处理，每个处理3个重复.

1.2.2 低磷胁迫处理

试验均于玻璃温室内进行，室温18～28 ℃，湿度75%，光照时长14 h/d.生长季节早晚各淋水1次，每次淋水淋透基质[23].试验期间均匀浇施1次无磷1/3 Hoagland/7d 营养液[24]，每盆每次浇施30 mL[25].接菌15 d后开始低磷胁迫处理，采用KH2PO4作为磷肥，设置4个磷处理水平[23,26]，分别为无磷处理(0 mg/kg)、重度磷胁迫(10 mg/kg)、轻度磷胁迫(20 mg/kg)和适量供磷(40 mg/kg)，每个水平3个重复，并分别对应F、I、E、N、FI、CK 6个接菌方式，共计72盆.分别于胁迫30，50，70，90 d时进行叶绿素含量取样测定[27].

1.3 测定方法

1.3.1 叶绿素含量测定

采用丙酮乙醇提取法测定叶绿素含量[28]，取大小相对一致的健康叶片，洗净吸干水分后，称取0.1 g鲜叶放入试管，加入15 mL混合液(丙酮与乙醇体积比为1∶1).在室温下暗反应24 h后，分别于663 nm和645 nm测定上清液的吸光度(A663和A645)，叶绿素含量(mg/g)计算公式如下：

叶绿素含量=(8.04×A663+20.3×A645)×

V/(1 000×W)，

式中，V为提取液总体积(mL)，W为叶鲜质量(g).各样品重复测定3次后取平均值.

1.3.2 叶绿素荧光特性测定

采用Os-5p型便携式叶绿素荧光仪(Opti-science，USA)于晴朗无云天气连续3 d(上午9：00—11：00)进行3次重复测定：选择植株中上部阳向枝条上展开的叶龄一致的叶片，用暗反应夹对叶片进行暗适应30 min后，测定待测叶片的初始荧光(Fo)、最大荧光(Fm)和可变荧光(Fv)，并计算光合系统Ⅱ(PSⅡ)的活性(Fv/Fo)及最大光能转换效率(Fv/Fm).

1.4 数据处理与分析

数据整理与作图均采用Excel 2007软件，采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)检验不同处理之间的方差显著性，并用Duncan法进行多重比较，P<0.05表示差异显著.

2 结果与分析

2.1 低磷胁迫下各菌种对叶绿素含量的影响

各菌株处理后台湾相思随胁迫时间增加，叶绿素含量变化表现出差异性(表1)：无磷处理下，随胁迫时间增加，菌株I处理组的叶绿素含量始终保持上升趋势；菌株FI与E处理组的叶绿素含量均随胁迫时间增加呈先升后降趋势，70 d时达最高值；其他处理组的叶绿素含量则均在50 d时达最低值.

重度磷胁迫下，菌株F与N处理组的叶绿素含量始终高于CK组，随胁迫时间增加总体呈先升后降趋势，70 d 时达最高值；其余组的叶绿素含量也均在70 d时达最高值，且高于CK组该时间点的值.

轻度磷胁迫下，菌株F、E和FI处理组的叶绿素含量始终高于CK组，其中菌株F与FI处理组的叶绿素含量均在70 d时达最高值，菌株E处理组的叶绿素含量则在50 d时达最低值.

适量供磷下，只有菌株I、N和FI处理组在30 d时叶绿素含量低于CK组，其他各处理组在各胁迫时间点的叶绿素含量均高于CK组，且除菌株I处理组外，均在70 d时达最高值；菌株FI处理组的叶绿素含量在70 d时最高，为3.543 mg/g，较CK组该时间点的值高73.68%.

菌株FI处理组在50 d的适量供磷下叶绿素含量高于其他处理组，在70 d的无磷处理、轻度磷胁迫及适量供磷下叶绿素含量均高于其他处理组，在90 d的轻度磷胁迫和适量供磷下叶绿素含量也高于其他处理组；菌株F处理组在50 d的轻、重度磷胁迫下叶绿素含量均高于其他处理组，菌株FI处理组在70 d的轻度磷胁迫下叶绿素含量最高，为3.644 mg/g.可见，菌株FI在适量供磷条件下整个胁迫期均可促进台湾相思叶绿素含量的提高，而菌株F和FI在低磷胁迫中后期均表现出明显的促进作用.

表1 不同内生真菌在不同试验天数及不同磷胁迫下对台湾相思幼苗叶片中叶绿素含量的影响Tab.1 Effects of different endophytic fungi on chlorophyll contents in the leaves of A.confusa seedlings under different experimental days and different phosphorus stress

2.2 低磷胁迫下各菌种对叶绿素荧光特性的影响

植物叶绿素荧光特性参数包含光合作用中许多重要信息，相较于气体交换指标(净光合速率、蒸腾速率等)，这些参数能迅速并且准确地反映植物光合系统的内在特性[29-30]，被视为无损伤探针，广泛应用于植物逆境生理和光合生理研究[31-32].

2.2.1 对PSⅡFv/Fo的影响

低磷胁迫下，各菌种处理组幼苗叶片的PSⅡFv/Fo在相同时间点未产生显著差异(P>0.05)，说明各菌种对PSⅡFv/Fo的影响较小；在不同的低磷胁迫下，各菌种处理组50 d时的Fv/Fo最大，且与30，70和90 d时的Fv/Fo相比差异显著(P<0.05)，说明50 d时各菌种对PSⅡFv/Fo的干扰效应最强(表2).

表2 不同内生真菌在不同试验天数及不同磷胁迫下对台湾相思幼苗叶片PSⅡFv/Fo的影响Tab.2 Effects of different endophytic fungi on PSⅡFv/Fo in the leaves of A.confusa seedlings under different experimental days and different phosphorus stress

差异显著(P<0.05)，表3同.

2.2.2 对PSⅡFv/Fm的影响

各处理组Fv/Fm在低磷胁迫下的表现如表3所示：无磷处理下，菌株F、N、FI处理组在50 d时Fv/Fm显著高于CK组(P<0.05)；重度磷胁迫下，仅菌株FI处理组在70 d时Fv/Fm显著高于CK组(P<0.05)；轻度磷胁迫下，仅菌株F处理组在70 d时Fv/Fm显著低于CK组(P<0.05)；适量供磷下，菌株E、N处理组在50和70 d时Fv/Fm显著高于CK组(P<0.05).

结果表明，接种菌株N在无磷处理和适量供磷的中前期对提高台湾相思PSⅡFv/Fm有明显的促进作用，接种菌株FI则在重度磷胁迫的中后期有明显的促进作用.

表3 不同内生真菌在不同试验天数及不同磷胁迫下对台湾相思幼苗叶片PSⅡFv/Fm的影响Tab.3 Effects of different endophytic fungi on the PSⅡ Fv/Fm in the leaves ofA.confusa seedlings under different experimental days and different phosphorus stress

2.3 不同叶绿素含量和叶绿素荧光参数的多因素方差分析

以菌株种类、试验天数和胁迫条件为处理因子，对台湾相思的叶绿素含量、Fv/Fo、Fv/Fm进行多因素方差分析，结果见表4：对于叶绿素含量，胁迫条件、菌株种类与试验天数的两两交互作用均有显著影响(P<0.05)；对于Fv/Fo，除试验天数有极显著影响(P<0.01)外，其他因素均无显著影响；对于Fv/Fm，菌株种类和试验天数有极显著影响(P<0.01)，三者交互作用有极显著影响(P<0.05)，其他因素则均无显著影响.

表4 菌株种类、试验天数和胁迫条件对台湾相思叶绿素含量和叶绿素荧光参数影响的多因素方差分析Tab.4 Multivariate analysis of the influence of strain types,test days and stress conditions on the chlorophyll contents and chlorophyll fluorescence parameters of A.confusa

3 讨论与结论

长期处于低磷胁迫条件下的植物，为维持叶光合作用等生理功能，通过优化叶绿素含量等磷利用机制来适应土壤低磷环境[33]，而叶绿素含量、叶绿素荧光参数是直接影响植物光合作用最重要的生理指标[34].本研究中接种内生真菌能有效缓解低磷条件给台湾相思带来的不良影响，不同程度促进台湾相思幼苗的叶绿素含量增加，其中菌株F和FI作用相对明显，说明内生真菌可缓解低磷胁迫对台湾相思幼苗叶绿素合成的抑制，通过提高合成叶绿素的能力增强光合作用，这与汤智德等[21]在低磷胁迫下内生真菌对植物生长及光合作用有正向影响的研究结论相同，暗示内生真菌具有与植物通过互作促进光合作用的能力[35].另有研究表明杉木(Cunninghamialanceolata)和水稻(Oryzasativa)等植物在低磷条件下，接菌苗较无菌苗叶片的叶绿素含量也均有明显提高[36-37].本研究所用的内生真菌是否有助于增加植物表面积吸收磷量，从而增强植物吸收含磷肥料的能力还有待进一步研究.

低磷胁迫对植物光合作用的影响不存在一致性规律，但内生真菌可使宿主所在土壤内的磷元素转化为可利用形式以提高植物抗性[38].本研究中，不同低磷胁迫下，各菌株处理组台湾相思幼苗的Fv/Fo无明显差异，但重度磷胁迫下70和90 d时各菌株处理组的Fv/Fo基本大于对照组，可能是50 d后各菌株开始发挥明显作用；除适量供磷条件外，90 d时各菌株处理组的Fv/Fm大部分高于对照组，表明接种内生真菌可以缓解低磷胁迫下台湾相思幼苗PSⅡ受到的损伤，进而提高光能转化效率.这与高婷[39]研究内生真菌侵染水稻幼苗后叶片的Fv/Fo、Fv/Fm均提高的结果相似.已有研究发现非胁迫条件下，Fv/Fm值的变化很小，一般为0.75～0.85[40]，本研究中台湾相思幼苗的Fv/Fm值范围为0.814～0.856，且在不同低磷胁迫下变化不大，说明磷缺乏对台湾相思光合特性的影响相对较小，与前人研究磷缺乏对落叶松(Larixgmelinii)Fv/Fm值影响不大的结论一致[41]；但也存在低磷胁迫下杉木Fv/Fm值明显升高的报道[21].可见不同树种在缺磷环境下代谢调节能力存在差异，如不同树种磷酸丙糖的转化能力直接影响卡尔文循环中二磷酸核酮糖再生环节[42].通常Fv/Fm值降低被认为光合作用受光抑制[43]，而本研究中Fv/Fm值未产生明显降低趋势，表明缺磷环境未对台湾相思幼苗产生光抑制作用.

本研究通过内生真菌回接不同低磷处理的台湾相思幼苗，对内生真菌与台湾相思共生体的叶绿素含量和叶绿素荧光参数进行测定分析，明晰了台湾相思中4种优势内生真菌对低磷胁迫下台湾相思叶绿素荧光特性的影响有所差异，其中菌株F、FI的促进作用最佳，可为改良台湾相思林分生长提供参考.然而，仅从优势内生真菌对台湾相思光合特性促进角度开展研究并不能系统地改良我国南方低磷生境中台湾相思的生长状况，进一步分析内生真菌对台湾相思根际酸度、有机酸分泌、磷酸酶释放及其对土壤磷活化的促进机制是后续研究的重点.