基于网络药理学和分子对接的痛泻要方治疗胃溃疡分子机制研究*

洪耀南 许佳烨 潘晓豪 余王琴

1 浙江中医药大学第一临床医学院 浙江 杭州 310053

2 浙江中医药大学基础医学院 浙江 杭州 310053

本研究通过运用网络药理学和分子对接技术探究痛泻要方治疗胃溃疡（GU）的分子机制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 收集药物潜在活性成分及靶点预测：痛泻要方包含陈皮、白芍、白术、防风4味中药。我们通过中药系统药理学在线平台(TCMSP)，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥0.3，类药性指数(drug-like‐ness，DL)≥0.18为临界值筛选出各味中药活性成分与靶点。

1.2 中药活性成分靶点预测与靶点标准化：根据从TCMSP中筛选出的中药活性成分及靶基因，并通过Swiss Target Prediction数据库、TargetNet数据库进行补充。同时，将3个数据库中查询到的靶基因进行汇总去重。

1.3 获取胃溃疡的相关基因：通过TTD、OMIM、Gene‐Cards三大数据库，以“gastric ulcer”为关键词进行快速检索得到已知的GU相关疾病靶标。

1.4 中药活性成分——靶点网络构建：将中药成分靶点和疾病靶点数据上传到在线网站Venny 2.1.0中，以VENN图的形式展现出来，其中交集部分为痛泻要方治疗GU的潜在靶点。并通过Cytoscape 3.7.2软件，以网络图的形式展现相互作用的关系。

1.5 构建蛋白互作网络筛选核心基因：将靶标集合输入在线STRING 11.0数据库,设置置信度=0.400，获取靶标蛋白的相互作用信息，用获得的相互作用关系数据构建PPI网络。

1.6 GO富集分析和KEGG通路富集分析：借助R×64 4.0.5软件以及Bioconductor生物信息软件包对痛泻要方治疗胃溃疡的药效靶点进行GO分子功能分析，根据P value进行排序，最后绘制出排序前10位生物过程(biological process，BP)、细胞组分(cellular com‐ponent,CC)、分子功能(molecular function，MF)的GO分子功能柱状图。利用R语言进行KEGG信号通路富集分析，根据P value进行排序，绘制前20位KEGG功能富集分析图气泡图，并利用KEGG数据库对筛选出的信号通路进行可视化。

1.7 潜在活性成分-核心靶点分子对接验证：利用AutoDock Vina(v1.1.2)对痛泻要方活性成分和胃溃疡相关靶点进行分子对接实验,验证其相互作用活性，并利用Pymol对结合能较低的几个组合可视化分析。

2 结果

2.1 痛泻要方的活性成分、靶点检索与筛选：通过TC‐MSP数据库检索，以OB≥0.30，DL≥0.18为临界值筛选共得出痛泻要方中的40个活性成分（去重），其中陈皮5个，白芍13个，白术7个，防风18个。将TCMSP检索与Swiss Target Prediction数据库、TargetNet数据库中查询到的靶点经 Uniprot数据库标准化注释后进行汇总去重，共得到442个靶点。

2.2 胃溃疡靶点检索及获取交集靶点：通过TTD、OMIM、GeneCards 3个数据库共检索收集到672个胃溃疡靶点。其中交集部分为痛泻要方治疗胃溃疡的潜在靶点，见图1。

图1 痛泻要方中药活性成分靶点与胃溃疡靶点VENN图

2.3 痛泻要方中药活性成分——靶点网络构建：通过Cytoscape 3.7.2软件，以网络图的形式展现痛泻要方中药成分与交集靶点相互作用的关系。图中478个节点,2420条边，其中来源于化合物的有36个，来源于基因的有442个，见图2；经统计，degree较高的有效成分为川陈皮素(nobiletin)、汉黄芩素（wogonin）、顺式-11,14-二十碳二烯酸甲酯(methyl icosa-11,14-die‐noate)、柚 皮 素 (naringenin)、亚油酸乙酯(Mande‐nol)等。

图2 痛泻要方活性成分-交集靶点网络图

2.4 蛋白互作网络构建：将交集靶点通过STRING 11.0软件，构建 PPI网络，见图3。共得到509对蛋白互作关系，涉及52个蛋白靶点。其中IL-6、TP53、AKT1、PTGS2、CASP3、TNF、JUN、MAPK1、CCND1、EGFR的度值排名较靠前，故认为是这几个靶点蛋白互作网络中的核心靶点。

图3 痛泻要方治疗胃溃疡的PPI网络模型

2.5 痛泻要方治疗胃溃疡的基因GO富集分析与KEGG富集分析：经过GO富集分析（图4）共得到1505条富集结果，其中生物过程（BP）1402个，主要涉及对化学应激的反应、对氧化应激的反应、对活性氧的反应、对营养水平的反应等生物过程进行调节；细胞组分（CC）22个，主要涉及囊腔、膜筏、膜微区、膜区等细胞组分；分子功能（MF）81个，主要涉及磷酸酶结合、蛋白酶结合、蛋白磷酸酶结合等。

图4 痛泻要方治疗胃溃疡的GO富集分析

对筛选出的靶蛋白进行KEGG通路富集分析，共获得83条富集结果。KEGG富集分析关键蛋白模块的相关通路排名在前20位的通路绘制气泡图，其中参与调控胃溃疡的信号通路包括糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路（AGE-RAGE signaling pathway indiabetic com‐plications）、脂质和动脉粥样硬化（lipid and ath‐erosclerosis）、乙型肝炎（Hepatitis B）等，见图5。并对其中关联度较高的糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路进行可视化分析，见图6。

图5 痛泻要方治疗胃溃疡的KEGG通路富集气泡图

图6 信号通路图

2.6 潜在活性成分-核心靶点分子对接验证：选取活性成分前5位的川陈皮素(nobiletin)、汉黄芩素（wogo‐nin）、顺式-11,14-二十碳二烯酸甲酯(methyl icosa-11,14-dienoate)、柚皮素(naringenin)、亚油酸乙酯(Mandenol)，分别与位于前5位的核心基因IL-6、TP53、AKT1、PTGS2、CASP3进行分子对接，见表1。结果表明，川陈皮素、汉黄芩素、柚皮素与IL-6、TP53、AKT1、PTGS2、CASP3的结合能均≤-5.0kcal/mol，具有较好的结合力，见图7。提示川陈皮素、汉黄芩素、柚皮素可能在痛泻要方治疗对胃溃疡中发挥了重要作用。

表1 痛泻要方中药活性成分与胃溃疡核心靶基因结合能

图7 化学成分与靶点的分子对接图

3 讨论

胃溃疡临床表现为慢性、周期性上腹部疼痛，故诸多医家将胃溃疡归于中医学“胃脘痛”范畴，因胃溃疡兼有腹部胀满、恶心等症状，又与“痞满”“呕吐”等关系密切。胃脘痛首见于《黄帝内经》，对其发病原因、伴随症状等均有详细描述，如《灵枢》云：“脾足太阴之脉……入腹属脾络胃……是动则病舌本强，食则呕，胃脘痛，腹胀善噫。”而正式做为独立病名存在则见于李东垣的《兰室秘藏·胃脘痛门》。肝主疏泄，脾主运化，若肝气疏泄功能太过、不及或障碍，横逆脾胃，可见脾气虚弱，不能运化水谷；胃失和降，气机不畅，日久则气滞血瘀或气虚血瘀，肉败血腐，形成溃疡，重则血不循经，外溢出血。因此胃溃疡是正虚邪实、虚实夹杂的复杂病证，与肝脾关系密切。

临床实践发现，当今社会竞争激烈、人们常处于精神紧张的状态，长期紧张、焦虑可导致精神抑郁，诱发胃溃疡的发生，早在1962年Susser等[1]就提出“都市化”的生活模式可能会导致胃溃疡的发生率升高。因此，胃溃疡患者不仅消化吸收功能差，且常有精神方面调节失衡，表现为感受性及情绪兴奋性过强，不易平复。这些表象与中医学对胃溃疡肝郁脾虚的病机认识不谋而合。

痛泻要方出自《景岳全书》，由陈皮、白芍、白术、防风4味药组成，具有调和肝脾、祛湿止泻之功效[2]。本研究采用网络药理学的方法探究其治疗胃溃疡的作用机制，共筛选得到40个活性成分及442个靶点，经活性成分-靶点网络筛选出痛泻要方在治疗胃溃疡中发挥作用的主要成分：川陈皮素、汉黄芩素、顺式-11,14-二十碳二烯酸甲酯、柚皮素、亚油酸乙酯等。现代研究表明，川陈皮素、汉黄芩素、柚皮素等具有良好的抗癌、抗氧化、抗炎、抗血栓形成的作用[3]，而抗氧化、抗炎等作用对胃溃疡的治疗具有重要意义。

通过PPI网络拓扑分析后预测得到IL-6、TP53、AKT1、PTGS2、CASP3、TNF等核心靶基因。研究表明，病理条件下，IL-6可刺激免疫细胞产生活性氧自由基、溶酶体酶等产物,并在溃疡的发生过程中起重要作用，且IL-6的高表达能够促使炎症的持续发生，最终导致胃黏膜损伤和胃溃疡的产生[4]；TP53的表达可调控细胞的生长与增殖，高表达会引起胃黏膜的炎症反应和胃溃疡的产生[5]；前列腺素G/H合成酶（PTGS）可将花生四烯酸转化为前列腺素H2，产生的前列腺素介导生理应激反应，导致感染和炎症等[6]。

在筛选得到蛋白互作网络的核心靶点中，AKT1为其中重要蛋白之一。通过分子对接发现其与痛泻要方主要成分的结合能均≤-5.0kcal/mol，具有较好的结合力，提示AKT1可能在痛泻要方治疗胃溃疡中发挥了重要作用。AKT1为AKT三个成员之一，为PI3K/AKT信号通路中的重要靶点之一，可通过AKT的磷酸化和去磷酸化等作用，影响下游效应因子，参与多种细胞过程[7]。在我们的研究中，AKT参与了排名前10的GO富集分析的所有生物过程，包括对化学应激的反应、对氧化应激的反应、对活性氧的反应等；在排名前20的KEGG富集分析中参与了糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路、脂质和动脉粥样硬化、乙型肝炎等18条信号通路。

现代研究表明，正常胃黏膜中AKT主要分布于黏膜肌层周围的胃底腺细胞质中，而在胃溃疡组织中主要分布于溃疡边缘与肉芽组织之中[8]。在胃溃疡的发生发展过程中，PI3K/AKT信号通路会被激活，胃组织AKT表达水平上升,促进炎症因子表达；而在胃溃疡修复的过程中，AKT的mRNA及蛋白表达水平均降低[9]，说明AKT与胃溃疡整个过程都存在一定的联系，可能是对胃溃疡的发生发展及治疗预后都有着主要作用。

综上所述，本研究通过运用网络药理学和分子对接，预测了痛泻要方治疗胃溃疡的主要作用靶点及多成分、多靶点、多通路作用机制。接下来，我们也将围绕痛泻要方治疗胃溃疡的活性成分和作用靶点及其相关通路进行实验，为临床治疗胃溃疡提供科学依据。