生长激素改善预后不良患者IVF助孕结局的分析

唐奕，胡嫦娥，彭扬琴，屈竞斐，林戈，龚斐*

(1.中南大学生殖与干细胞工程研究所，长沙 410078；2.中信湘雅生殖与遗传专科医院，长沙 410078)

对于体外受精(IVF)周期无获卵、胚胎质量差导致临床结局不良的患者，目前临床上暂无特别有效的治疗方法。随着对生殖生理各个环节的深入研究，人们逐渐认识到促性腺激素(Gn)并非是调节卵巢功能的唯一用药，生长激素(GH)及各种肽生长因子对卵巢和卵泡发育也具有重要的意义。GH可以直接与卵巢局部GH受体结合或间接上调局部胰岛素样生长因子-1的合成来调节促卵泡生成素(FSH)，并与Gn协同作用，增强颗粒细胞内芳香化酶活性，促进甾体激素的合成，从而促进卵泡发育[1]。颗粒细胞上FSH受体及促黄体生成素(LH)受体的表达是卵泡发育的关键，研究显示，GH能提高高龄患者颗粒细胞中GH受体、FSH受体和LH受体的表达量，增加卵母细胞对Gn的敏感性，促进卵泡发育，提高卵母细胞质量，最终提高妊娠率和活产率[2]。本研究通过回顾性分析本中心既往出现无获卵以及胚胎质量差导致临床结局不良的患者接受 GH小剂量长程预处理治疗前后的妊娠结局，探讨GH在改善胚胎质量及临床妊娠结局方面的疗效。

资料和方法

一、研究对象

回顾性分析2019年12月至2021年7月在中信湘雅生殖与遗传专科医院进行IVF助孕临床结局不良的患者，包括前次IVF助孕周期无可用卵母细胞以及胚胎质量差患者(优质胚胎率≤20%)。

纳入标准：(1)首次IVF助孕因无获卵、胚胎质量差(优质胚胎率≤20%)导致助孕失败；(2)首次IVF助孕未接受GH药物辅助治疗，之后接受GH预治疗；(3)月经周期规律25～30 d；(4)体质量指数(BMI)≤28 kg/m2；(5)基础FSH、LH、雌二醇(E2)、睾酮(T)水平处在正常范围内；(6)既往HCG日或移植日内膜厚度≥7 mm。

排除标准：前次受精失败及其他妊娠不利因素，如粘膜下子宫肌瘤、中重度宫腔粘连、内膜结核、子宫畸形、严重内分泌疾病以及男性重度弱精子症、畸形精子症等。

本研究共纳入479例患者，比较患者GH预处理前后两个周期的相关指标。

二、研究方法

1.促排卵方案：促排卵方案选择拮抗剂方案和黄体期长方案，方案调整的参考指标包括抗苗勒管激素(AMH)、窦卵泡计数(AFC)、FSH和年龄。

拮抗剂方案促排卵：于月经周期第2～3天接受B超和内分泌检查，开始以Gn(金赛恒，长春金赛药业)150～300 U促排卵，连续用3 d后，每日或隔日B超监测卵泡生长情况及激素变化，以调整促性腺激素用量，当出现1个卵泡直径≥12 mm时，加用拮抗剂(加尼瑞克，默沙东，德国)0.25 mg每日注射直至HCG日，当出现至少2～3个卵泡直径≥18 mm或仅有的1～2个卵泡≥17 mm时，当晚皮下注射绒毛膜促性腺激素(HCG，珠海丽珠)5 000～10 000 U及GnRH-a(达必佳，辉凌，德国)200 μg扳机，于HCG日35～36 h后经阴道B超下取卵。

GnRH-a长方案促排卵：黄体中期予GnRH激动剂(醋酸曲普瑞林，益普生，法国)1.5 mg降调14 d后，以Gn150～300 U促排卵，连续用3～4 d后，每日或隔日B超监测卵泡生长情况及激素变化，以调整促性腺激素用量，当出现至少2～3个卵泡直径≥18 mm或仅有的1-2个卵泡≥17 mm时，当晚皮下注射绒毛膜促性腺激素5 000～10 000 U扳机，于HCG日35～36 h后经阴道B超下取卵。

2.生长激素预处理：促排启动日前两个月经周期的黄体中期，患者开始接受重组人生长激素(赛增，2 IU/支，长春金赛药业)2 IU/d，至促排卵开始后剂量改为4 IU/d直至HCG日结束。

3.受精及胚胎评分：取卵后行IVF或卵胞浆内单精子注射(ICSI)16～18 h观察受精情况。胚胎评分标准：根据卵裂球大小均匀与否及无核碎片量的多少进行胚胎质量评级，将胚胎分为4级。Ⅰ级：胚胎卵裂球连接良好，大小均匀，形态规则，透明带完整，无颗粒，碎片≤5%。Ⅱ级：卵裂球形态规则或轻度不规则，大小均匀或稍欠均匀，可有颗粒，碎片≤20%。Ⅲ级：卵裂球胚胎内碎片少于50%，碎片外卵裂球形态同Ⅱ级，具有一定折光性，透明带完整。Ⅳ级：胚胎内碎片≥50%，碎片外卵裂球具有生存活力。根据这个评级标准，将第3日(D3)为Ⅱ级6细胞以上的胚胎评为优质胚胎。

4.胚胎移植及黄体支持：取卵3～5 d后在腹部超声引导下进行胚胎移植术，取卵日常规使用黄体酮阴道缓释凝胶(雪诺同，90 mg/支，默克雪兰诺，瑞士)1支/d，进行黄体支持。移植后2周测定血β-HCG(HCG>5 U/L为阳性)，移植28 d后超声检查提示孕囊或流产物检查见绒毛者诊断为临床妊娠。

三、观察指标

1.主要研究指标：D3优质胚胎数。

2.次要研究指标：Gn总量、Gn天数、扳机日内分泌激素(E2、P、LH)水平、扳机日内膜厚度、获卵数、D5囊胚数、D6囊胚数、D7囊胚数、因卵母细胞因素取消周期率、因胚胎因素取消周期率、临床妊娠率。临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期总数×100%；因卵母细胞因素取消周期率=(无获卵+无成熟卵+获异常卵周期数)/取卵周期数×100%；因胚胎因素取消周期率=无可移植胚胎周期数(排除无获卵+无成熟卵+获异常卵+全部异常受精周期数)/取卵周期数×100%。

四、统计学方法

结 果

一、患者基本资料

共纳入479例患者，平均年龄34.65±4.72岁，BMI 21.49±2.09 kg/m2，AMH水平2.90±2.64 ng/ml，不孕年限4.11±3.04年。GH干预前后周期的受精方式(IVF/ICSI)无变化。患者不使用GH的周期和使用GH的治疗周期间隔不超过半年。

使用GH预处理周期与前一周期相比较，HCG日的血清激素水平、内膜厚度及≥12 mm的卵泡个数均无显著差异(P>0.05)(表1)。

表1 患者使用GH干预前后HCG日血清激素水平及子宫内膜情况

二、患者使用GH干预前后的促排卵情况及临床结局

与干预前的周期相比，患者接受GH干预后，移植胚胎数、移植日内膜厚度、D7天囊胚数无统计学差异(P>0.05)；使用GH周期的Gn促排天数、Gn总量显著减少，获卵数显著增多，D3优质胚胎数，D5、D6天囊胚数均显著增多(P<0.05)；GH干预后，移植周期数173例，临床妊娠率39.88%，干预前移植周期数156例，临床妊娠率7.05%，临床妊娠率显著升高(P<0.05)(表2)。

表2 患者使用GH干预前后的促排卵、胚胎情况及临床妊娠比较

三、使用GH干预前后的取消移植周期原因比较

GH干预前，479例患者取消移植周期323个，干预后，有306取消移植周期。比较患者GH干预前后两个周期中取消移植的原因，结果显示，卵母细胞因素取消周期率在干预前后无统计学差异(P>0.05)；使用GH干预后，因胚胎因素取消周期率显著降低(P<0.001)，而因其他原因取消周期数在使用GH的周期中显著增多(P<0.001)(表3)。

表3 GH干预前后患者取消移植周期的原因比较[n(%)]

四、按照前一周期不同获卵数分组患者GH干预后的获卵数及优胚数比较

479例患者按照前一周期获卵数分为3组：≤3枚组(n=92)、4～9枚组(n=226)和≥10枚组(n=161)，比较各组GH干预后获卵数变化。统计结果显示，与GH干预前相比，3组的D3优胚数均显著增加(P<0.001)；前一周期获卵数≤3枚组患者的获卵数显著增加(P<0.001)，但Gn总量和Gn天数无显著性变化(P>0.05)；前一周期获卵数4～9枚组患者，Gn总量显著减少，Gn天数显著缩短(P<0.001)，但获卵数没有显著性差异(P>0.05)；前一周期获卵数≥10枚组，Gn天数显著变短(P<0.001)，但Gn总量及获卵数无显著性差异(P>0.05)(表4)。

表4 按前一周期获卵数分组情况比较

讨 论

胚胎质量是决定移植成功的关键因素[3]。研究表明，劣质胚胎移植会导致更高的流产率和较低的持续妊娠率[4]。据统计，在体外受精-胚胎移植(IVF-ET)过程中，均为劣质胚胎的周期发生率约占12%[5]。如何改善此类患者的胚胎质量，进而提高IVF助孕的成功率，目前是一个棘手的问题。

众所周知，胚胎的质量与卵母细胞及精子质量密切相关，其中卵母细胞质量是影响胚胎发育的重要因素[6]。从始基卵泡到初级卵泡的启动募集、窦前卵泡向窦状卵泡发育、窦状卵泡到成熟卵泡排卵的过程，GH均扮演了重要的角色[1]。研究证实[7]，高龄妇女卵母细胞表面GH受体和细胞质内功能性线粒体的数量明显低于年轻女性。当给高龄女性添加GH治疗后，功能线粒体的数量显著升高。同样，Li等[8]的研究发现 对于至少有一个IVF周期失败并且没有高质量的胚胎(1级或2级)的患者，添加GH能显著提高其卵裂期胚胎数、临床妊娠率、活产率及卵泡颗粒细胞线粒体DNA的数量。Gong等[9]对卵巢低反应(POR)患者运用GH 4 IU/d预处理6周，能够显著降低卵泡颗粒细胞中的活性氧的水平，减少线粒体DNA的损伤，最终提高优质胚胎数量。线粒体是卵母细胞及胚胎发育过程中极其重要的细胞器，它为两者的发育提供足够的能量。而GH可以直接和卵母细胞表面的生长激素受体结合发挥作用，提高功能线粒体的数量，最终提高卵母细胞质量。

同时，颗粒细胞在卵母细胞发育中也扮演着重要角色，主要发挥营养支持和调控两方面重要的作用。研究发现将小鼠窦前卵泡取出后进行体外培养，添加GH可以促进颗粒细胞的增殖[10]。将高龄不孕女性的卵泡取出，在体外培养，发现添加GH可以明显提高颗粒细胞表面的FSH受体、LH受体及GH受体的表达量，进而增加卵母细胞对Gn的敏感性，促进卵泡发育，最终提高卵母细胞质量[2]。缝隙连接蛋白是颗粒细胞与卵母细胞间进行小分子代谢底物交换的桥梁，如果缝隙连接表达缺失，最终会导致颗粒细胞凋亡、卵泡闭锁等。所以，缝隙连接蛋白在卵母细胞发育过程中扮演着重要的角色。一项动物研究表明：添加GH可以促进卵泡早期发育中connexin-43蛋白(缝隙连接亚单位)表达增加[11]。因此，GH有可能利于提高卵母细胞质量，进而改善胚胎质量，进一步提高临床妊娠率。本研究纳入既往IVF助孕周期中无可用卵母细胞及胚胎质量差的患者进自身前后对照分析。结果显示：给予GH小剂量长程预处理治疗后，患者使用Gn天数显著减少，Gn总量有所减少的情况下，获卵数增加；且D3优质胚胎数、D5和D6囊胚数明显增多；添加GH治疗后临床妊娠率较治疗前显著增加，前期一些研究结果基本一致。Chen等[12]对先前的IVF周期中未怀孕的卵巢储备功能低下的患者进行GH 剂量为2 IU/d预处理4周，结果发现添加GH组患者，最终的获卵数增加，并且累积临床妊娠率更高。唐莉等[13]研究发现POR患者行IVF助孕添加GH有助于改善卵巢反应和临床结局。本研究考虑到获卵数是影响妊娠结局的重要因素，所以根据前次获卵数进行亚组分析，结果显示：前次周期获卵数≤3枚组，经过GH治疗后获卵数及D3优质胚胎数显著提高(P<0.001)；在前次获卵数4～9枚组和前一周期获卵数≥10枚组中，经过GH治疗未见获卵数有显著增加，只有D3优质胚胎数较GH干预前显著增加(P<0.001)。进一步分析了3组患者的Gn使用量和Gn使用天数，发现前次周期获卵数≤3枚组在GH干预前后后Gn用量和天数无统计学差异(P>0.05)，说明在Gn用量和Gn天数无差异的条件下，GH治疗确实改善了此组人群的获卵数和D3优胚数。而前次获卵数4～9枚组和前一周期获卵数≥10枚组，Gn使用的总剂量无显著差异，但添加GH后Gn使用天数显著缩短(P<0.001)。这个结果有以下2种可能性：(1)GH促进颗粒细胞表面FSH及LH受体的表达量，增强颗粒细胞对Gn的敏感性，进而缩短了用药时间。(2)在添加GH的周期，如果Gn使用总量前后无差异，Gn促排天数缩短，那有可能是增加了每日Gn的使用量，最终导致了Gn使用天数缩短。因本研究为自身前后对照研究，个别患者在下一个治疗周期中，促排方案及促排剂量上有了一些调整，增加了前后对照的干扰因素。但本研究仅纳入拮抗剂方案和激动剂长方案两种超促排卵方案，既往有Mate分析显示：在低预后人群中，使用拮抗剂方案和激动剂长方案进行超促排卵最终的获卵数、临床妊娠率无显著差异[14]。在ESHRE的指南中同样提到：在卵巢低反应人群中，GnRH激动剂和GnRH拮抗剂方案之间在安全性和疗效方面没有差异[15]。在本研究中个别患者的促排方案做了调整，但也是在黄体期长方案和拮抗剂方案之间的调换，所以认为本研究因为促排卵方案不同对最终IVF助孕结局的分析带来的干扰可以暂不考虑。另外，本研究未设置未使用GH治疗的平行对照组，这些均为本研究的局限性。但通过本次回顾性分析，我们发现小剂量长程的GH预处理治疗可能为前次促排卵周期无获卵、无优质胚胎的患者找到提高获卵数、改善胚胎质量，进而提高临床妊娠率的新方法。

目前关于GH是否能提高低预后患者的妊娠率和活产率是存在争议的。一些Meta分析证实GH可以提高妊娠率和活产率[16-18]，但这些Meta分析中纳入的RCT研究人群异质性较大，存在POR诊断标准不一致，GH治疗剂量、用法以及运用时机不一致，促排卵方案不一致等问题。Zhu等[19]运用波塞冬标准对POR进行诊断，明显减小了因为年龄导致的人群异质性，该研究显示GH未能提高新鲜胚胎移植后的妊娠率和活产率，但由于该研究是回顾性研究，在IVF治疗过程中是否使用GH是根据医生的经验，以及患者的经济承受力决定，所以，可能会存在患者选择偏倚。Cai等[20]运用GH预处理6周治疗符合波塞冬诊断标准的卵巢储备功能低下的患者，发现在波塞冬3组中，未见到添加GH有明显的获益；但在波塞冬4组，即年龄≥35岁的低储备患者，添加GH可以明显提高优质胚胎的数量、同时降低流产率、提高活产率。

综上所诉，GH小剂量长期预处理可以使无获卵或无优质胚胎的结局不良患者在下次进行IVF助孕时获卵数增多、胚胎质量得到改善，最终获得较多的优质胚胎，进一步提高临床妊娠率。但GH的确切应用价值尚待扩大样本量及高质量的前瞻性随机双盲对照试验来进一步证实。