信阳地区番茄果腐病病原菌的分离鉴定

谷清义，梅 阳，耿晓桐，张耀洲，申 君

（信阳农林学院，河南信阳 464000）

番茄（）是一年生茄科植物，原产于南美，因其独特的风味和较高的营养价值而成为全球蔬菜的主要栽培品种，成为全球消费最多的蔬菜之一。番茄在生长过程中病害多达20多种。其中，番茄果腐病是果实成熟与贮藏期极易发生的一种病害，严重影响番茄的品质。番茄果腐病的危害以成熟果实为主，发病初期果面呈现浅色斑，后期病斑呈褐色，无清晰边缘，扩大后布满整个果面。严重时引起果实腐烂，脱落。

番茄果腐病在信阳地区多有发生，严重影响番茄的产值和品质。本试验以信阳市甘岸镇蔬菜大棚采摘的番茄为研究对象，采用组织分离法对病原菌进行分离纯化，利用柯赫氏法则进行致病性测定，并结合形态特征和18S rDNA-ITS 基因序列对病原菌进行初步鉴定，为进一步研究信阳番茄病害的发生规律及防治提供理论依据，以期为培育抗番茄果腐病材料提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料：采自信阳市甘岸镇大棚番茄，贮藏期间自然发病的果实。

接种材料：新鲜、健康的番茄，购自超市。

PDA 培养基：马铃薯200 g、蔗糖20 g、琼脂15 g、无菌蒸馏水定容至1000 mL（高压蒸汽121℃灭菌20 min）。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌的分离纯化

采用组织分离法进行病原菌的分离纯化。在超干净工作台上，于发病果的病健交界处取约3 mm×3 mm 的块状果皮组织，用体积分数75%的酒精消毒15 s，3%的NaClO 溶液消毒15 s，无菌水冲洗4 次，用无菌滤纸吸掉表层水分。将组织块转移到PDA 平板上，在25℃恒温箱中培养，待菌落长出后挑取边缘菌丝进行纯化培养，重复3 至4 次纯化培养，获得的纯化菌株在4℃条件下保存备用。

1.2.2 病原菌的致病性测定

按照柯赫氏法则对分离到的病原菌进行致病性测定。将分离得到的病原菌在PDA 上25℃黑暗培养5 d，将病原菌用无菌蒸馏水制成浓度1×10个/mL的孢子悬液。选取无病健康的番茄果实，用2%的NaClO 溶液浸泡2 min，无菌水冲洗并晾干。用灭菌过的接种针在番茄果实表面刺出伤口，在伤口处接种孢子悬液30 μL；设5 次重复，以清水作对照，置于25℃保湿培养，待发病后从接种发病的果实上再次分离出致病菌株病原菌，完成柯赫氏法则验证。

1.2.3 病原菌的形态学鉴定

将菌株转接到PDA 培养基上，置于恒温箱中25℃恒温培养，每天观察菌株在培养基的生长状况，5 d 后在光学显微镜下观察菌落的培养特征、菌丝体形态、分生孢子的形态以及有无分生孢子梗等特征，根据病原菌的形态特征，初步判断病原菌的分类地位。

1.2.4 病原菌的分子鉴定

将菌株转接到PDA 培养基上培养，5 d 后菌丝布满培养皿。刮取新鲜菌丝，采用CTAB 法提取FQ-1菌株的总DNA。对FQ-1 菌种的DNA 进行PCR扩增，PCR 扩增采用真菌核糖体DNA 通用引物ITS1 和ITS4，ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；ITS4：5’-TCCTCCGCT TATTG ATATGC-3’。将PCR 扩增后得到的产物送到武汉擎科生物科技有限公司测序，测序结果与GenBank 中相关序列进行比对分析，以确定FQ-1 菌株类别。

2 结果与分析

2.1 病原菌FQ-1 的发病症状和分离

利用组织分离法从10 份番茄病果上分离培养并纯化后，获得6 株病原菌，将其中一株优势菌株命名为FQ-1，进行后续试验。该病害危害番茄成熟的果实（图1A），发病部位有形成不规则的圆形、白色乃至黄白色病斑，病斑处略凹陷有白色絮状菌丝，后期病斑变成暗黄色，果实腐烂，散发出异味。

2.2 病原菌FQ-1 的致病性检测

将分离得到的病原菌FQ-1 采用离体刺伤接种法接种于健康果实表面（图1B）。接种3d 后番茄表面有明显病斑，导致番茄表面形成圆形，黄白色、水渍状病斑，病斑凹陷能看到清晰边缘，随后变成暗黄近褐色，病部褐变软腐，有异味，与自然番茄发病的症状相同。对回接发病果实进行再分离，获得与接种菌菌落特征一致的分离物，说明分离病原物为致病菌。

图1 番茄果腐病自然发病（A）和人工接种（B）症状

2.3 FQ-1 菌株形态学鉴定

从自然发病的番茄上分离出病原菌，经形态学初步鉴定，属于镰刀菌属（）。将分离到的病原菌依照柯赫氏法则回接鉴定，发现为致病菌株。

FQ-1 菌在PDA 培养基上培养时生长迅速（图2A），3d 菌落直径达到52 mm，大量气生菌丝初期为白色后变为暗黄色，PDA 培养基背面为白色或米黄色。分生孢子顶细胞弯曲（图2B），两端尖，具单隔膜，无色透明；未见厚垣孢子，分生孢子大小不一，内部有0～3 个隔膜。

图2 番茄果腐病病原菌FQ-1 形态特征

2.4 FQ-1 菌种的分子鉴定

提取病原菌FQ-1 的总DNA，对rDNA-ITS 基因序列进行PCR 扩增，获得的基因片段大小为565 bp，将获得的 rDNA-ITS 序列（登录号：ON993227）与GenBank 上的序列进行比对，发现其与（MT032393）、（MT012109）、（MK228625）、sp.（GQ352485）、（MG020430）、（MT032394）等6 种镰刀菌的同源性都99%以上。因此初步确认FQ-1 菌株是镰刀菌，仍需对其序列和序列进行测定，将FQ-1菌种鉴定到种。

3 结论与讨论

番茄因果皮薄、组织柔嫩多汁并富含糖分，采后储存过程中容易感染微生物而发病腐烂。番茄成熟期或采后病害主要是果腐病。番茄果腐病的主要原因是病原菌的入侵。有研究表明，引起番茄果腐病的病原菌主要有尖孢镰刀菌（）、灰葡萄孢（）、扩展青霉（）和立枯丝核菌（）等。本试验通过对信阳市甘岸镇大棚番茄进行形态学鉴定和分子生物学鉴定，初步确定从番茄上分离纯化得到的病原菌FQ-1 为镰刀菌，与王振学等从番茄中分离的病原菌为尖孢镰刀菌相同。镰刀菌（）广泛存在于自然界中，是一类重要的植物病原真菌，能够引起寄主产生根腐、萎蔫、叶斑、果腐等症状，危害果实比较严重，绿果和红熟果都可以发病，红熟果发病更严重。镰刀菌除引起番茄果腐病外，还能造成番茄枯萎病、甘草根腐病、豌豆根腐病、蚕豆苗期根腐病、马铃薯根腐病等。

本试验利用rDNA-ITS 序列仅鉴定出果腐病菌属于镰刀菌，而未将FQ-1 菌株鉴定到种，接下来需对其序列和序列进行测定，对其进行准确鉴定，并对其生物学特性和防治药剂进行研究。