针药合用通过调控TGF-β1信号通路促进肾虚型排卵障碍大鼠卵巢颗粒细胞形态的恢复*

刘龙阳, 张丽华, 庄晨玉, 于彩崎, 纪娜, 罗立梅, 曾朝阳

南方医科大学中西医结合医院妇科(广东广州 510315)

排卵障碍相关的子宫异常出血(abnormal uterine bleeding-ovulatory dysfunction，简称AUB-O)多发生于青春期及绝经前期，约占AUB的80%～90%。现代医学认为该类疾病的主要病机为调控生殖的下丘脑(H)-垂体(P)-卵巢(O) 轴(简称HPO轴)初建不成熟或功能紊乱，从而引起内分泌失调导致子宫异常出血，是女性常见疾病之一[1-4]。而中医学[5]认为本病的主要发病机制是冲任损伤，不能制约经血，多见于少女先天禀赋不足，天癸初至，肾气雅弱，肾阳不足，冲任未充；或大病久病，损及于肾。治疗上以补肾固冲止血为法。目前，AUB-O的治疗在西医方面主要用性激素、人工周期等建立HPO轴正常反馈功能的方法，但存在药物不良反应较大及停药后恢复排卵率低且复发率高等不足。与西药相比，中医药治疗AUB-O的不良反应甚少，且治疗结束后复发率低，故近年来中医药治疗该类疾病的运用越来越多[6]。其中针药合用治疗AUB-O也已有相关报道，但究其治疗的具体机制研究不深入。众所周知，排卵主要与卵巢颗粒细胞有关。转化生长因子(TGF)-β1是一种多效能的细胞因子，参与了卵巢颗粒细胞增殖和卵母细胞成熟等生理过程，并可调节数种关键的颗粒细胞酶，对保持理想的卵巢内环境发挥着重要的作用[7]。卵巢局部的TGF-β1水平异常可导致卵泡发育异常和排卵障碍。因此，检测此通路中的相关指标，对于研究卵巢颗粒细胞形态学改变的具体机制具有重大的意义。近年来，针刺、中药在促排卵、调节卵巢颗粒细胞增殖与凋亡，以及在改善HPO轴的内分泌功能已有研究报道[8-9]。尽管如此，目前关于针药合用治疗肾虚型排卵障碍大鼠卵巢颗粒细胞形态学改变的具体机制尚未见报道。2017年10月至2019年8月本研究从TGF-β1信号通路的表达情况探究针药合用对肾虚型排卵功能障碍大鼠卵巢颗粒细胞形态学改变的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 健康SD雌性大鼠40日龄80只。饲养于12 h光照和12 h黑暗的环境中，温度20～26℃，湿度40%～70%，自由摄食和饮水。由南方医科大学实验动物中心提供，生产许可证号SCXK(粤)2006-0015。中药补肾健脾方水煎剂(南方医科大学中西医结合医院提供)，将生药党参20 g, 白术15 g, 熟地20 g, 菟丝子15 g, 淫羊藿10 g, 仙茅10 g, 川断10 g, 杜仲10 g, 山茱萸15 g加水煎煮2次，合并煎液、过滤、浓缩成每1 mL含生药1.5 g的中药混悬液。研究经本院医学伦理委员会审核。

1.2 方法

1.2.1 肾虚型排卵障碍大鼠动物模型的构建 造模组大鼠按羟基脲450 mg/kg灌胃，连续灌胃8 d，造模成功。对模型组大鼠分别给予针刺+中药(针药合用组)、中药+假针(中药组)、针刺+安慰剂中药(针刺组)、假针+安慰剂中药(空白对照组)处理。给药量按人与大鼠体表面积比换算得出，针刺穴位定位依据林文注“实验针灸学”。(1)空白对照组：生理盐水灌胃1 mL/100 g后，于木板上捆绑四肢20 min，腹部朝上，1次/d，共5 d。(2)针刺组：于木板上捆绑四肢腹部朝上，取穴气海、关元、双侧三阴交。进针0.3 cm，行平补平泻法，电针20 min，以肢抖动为度，1次/d，连续5 d。(3)中药组：补肾健脾方水煎剂混悬液，灌胃按1 mL/100 g后，于木板上捆绑四肢20 min，腹部朝上，1次/d，共5 d。(4)针药合用组：于木板上捆绑四肢腹部朝上，补肾健脾方水煎剂混悬液灌胃(剂量同上)合用针刺(取穴及针法同上)，1次/d，共5 d。

1.2.2 RT-qPCR技术 取各组大鼠新鲜的卵巢组织，于研钵粉碎，加入Triol并按RNA提取试剂盒的指示提取Total RNA，然后按照试剂盒进行基因组DNA去除、逆转录及实时荧光定量PCR等实验步骤。以空白对照组作为对照组，以β-actin作为内参照，分别检测其余三组大鼠卵巢新鲜组织中的TGF-β1、smad3以及smad7的mRNA表达情况。RT-qPCR特异性引物(TGF-β1正向：5′-TGCTTCAGCTCCACAGAGAA-3′、反向：5′-TGGTTGTAGAGGGCAAGGAC-3′； smad3正向：5′-GGC-AGGATGTTTCCAGCTA-3′、反向：5′-GCAGTCCACAGA CCATGTCA-3′；smad7正向：5′-GACAGCTCAATTCGGACAACA-3′、反向：5′-CAGTGTGGCGGACTTGATGA-3′；β-actin正向：5′-AGGGAAAT-CGTGCGTGACAT-3′、反向：5′-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3′)。

1.2.3 Western blot技术 取各组大鼠新鲜的卵巢组织，于研钵粉碎，加入RIPA蛋白裂解液、蛋白酶抑制剂及磷酸化酶抑制剂进行细胞裂解，并按Western blot操作流程进行变性、定量调平、电泳、电转、孵一抗、洗膜、孵二抗、洗膜、曝光等步骤。分别检测各组大鼠卵巢组织中的TGF-β1、smad3以及smad7的蛋白质表达情况。

2 结果

2.1 4组大鼠新鲜卵巢组织中TGF-β1通路因子的mRNA表达情况 取各组大鼠新鲜的卵巢组织行RT-qPCR实验检测TGF-β1通路(包括TGF-β1，smad3和smad7)因子的mRNA表达情况，结果显示：针刺组、中药组及针药合用组的TGF-β1及smad3的表达均较空白对照组明显降低，而smad7的表达均较空白对照组明显升高；且针药合用组TGF-β1及smad3的表达水平较其他三组最低，而smad7表达较其他三组最高。见表1。

表1 各组大鼠卵巢组织中TGF-β1通路因子的mRNA表达情况

2.2 4组大鼠新鲜卵巢组织中TGF-β1通路因子的蛋白表达情况 取各组大鼠新鲜的卵巢组织行Western blot实验检测TGF-β1通路(包括TGF-β1，smad3和smad7)因子的蛋白表达情况，结果显示：针刺组、中药组及针药合用组的TGF-β1及smad3的表达均较空白对照组明显降低(P<0.01,P<0.001)，而smad7的表达均较空白对照组明显升高；且针药合用组TGF-β1及smad3的表达水平较其他三组最低，而smad7表达较其他三组最高(图1)。

注：与空白对照组比较*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

3 讨论

本研究中药自拟补肾健脾方，组方为党参，白术，熟地，菟丝子，淫羊藿，仙茅，川断，杜仲，山茱萸，黄精。针刺取穴：气海、关元、两侧三阴交，行平补平泻法[10]。关元为足三阴与冲任之会，又为经血之室。任脉起于胞宫，主一身之阴，故关元可补肾健脾，调补冲任；气海位于任脉，是治肾虚要穴，具有补脾统血之功。上述诸穴合用共奏补肾健脾，益气固摄之功。前期研究中，我们课题组的研究[11]发现针药合用能提高大鼠出现动情周期的比例，且能明显提高未成年大鼠血清FSH、LH及P的水平，表明针药合用可以促进卵泡发育及排卵，使增殖期内膜转化为分泌期，从而可以治疗青春期功血。

本研究中我们采用针药合用处理肾虚型排卵障碍大鼠，然后对各组大鼠的卵巢新鲜组织进行RT-qPCR扩增，结果发现针药合用组TGF-β1相关通路包括TGF-β1、TGF-β1受体及smad3 mRNA表达较其他组别均明显降低，而smad7 mRNA表达较其他组别明显升高。进一步的Western blot检测结果显示：针药合用组TGF-β1相关通路包括TGF-β1以及smad3蛋白表达较其他组别均明显降低，而smad7蛋白表达较其他组别明显升高。该结果初步提示针药合用可能通过下调TGF-β1信号相关通路进而促进肾虚型排卵障碍大鼠卵巢颗粒细胞形态学的恢复。而TGF-β1是一种多效能的细胞因子，具有广泛的生物学效应。研究发现其参与卵巢颗粒细胞增殖和卵母细胞成熟等生理过程，并可调节数种关键的颗粒细胞酶，对保持理想的卵巢内环境发挥着重要的作用[7]。卵巢局部的TGF-β1水平异常可导致卵泡发育异常和排卵障碍。非活性的TGF-β1被各种酶及活性因子激活时，引起 TGF-β1大量生成和激活，迅速通过与细胞膜上的TGF-β1受体相结合从而激活细胞内的TGF-β1下游smads信号转导通路[12]，进而使smad2/3磷酸化，继而与smad4相结合形成转录复合物，随即将信号转入细胞核内，调节特定基因的表达，发挥其相应的生物学效应[13-14]。与smad3/4作用相反的是smad7，其在 TGF-β1信号传导中构成负调节反馈通路。该蛋白激活后可阻断其信号通路的转导[12]。因此，本研究证实了针药合用可能通过抑制TGF-β1信号通路从而促进肾虚型排卵障碍大鼠卵巢颗粒细胞形态学的恢复。

综上所述，针药合用可能通过抑制TGF-β1信号通路，进而抑制smad3、促进smad7的表达，从而促进肾虚型排卵障碍大鼠卵巢颗粒细胞形态学的恢复，进而促进其卵巢功能的恢复。该研究将为临床改善肾虚型排卵障碍患者的卵巢功能提供一定的实验依据及理论基础，为下一步临床前研究提供一定的理论价值。

利益相关声明：文章所有作者无利益冲突。

作者贡献说明：刘龙阳负责实验及论文撰写，张丽华负责实验模型建立，庄晨玉负责动物处理，于彩崎负责论文修改，纪娜负责数据整理，罗立梅负责文献查找，曾朝阳负责课题监督及论文修改。