无柄灵芝醇提物对小鼠睡眠及肠道菌群的影响

陈天赐 武少兰 杨国辉 江丹霞 江玉姬 陈炳智

（1. 福建农林大学食品科学学院 福州 350002；2. 福建农林大学菌物研究中心 福州 350002）

睡眠是维持人体健康的一个重要过程，长期失眠可能引起调节失衡，免疫力下降，内分泌激素混乱，诱发阿尔茨海默等疾病［1-3］。研究表明，世界上超过三分之一的人患有失眠症，该人群数量还在不断增加［4］。睡眠-觉醒主要受中枢神经系统的调节，肠道菌群能通过肠-脑轴的神经调节、内分泌和免疫调节，与中枢神经系统相互作用［5-6］。Reynolds等［7］研究表明睡眠不足和昼夜节律紊乱会产生生理压力，进而改变肠道菌群和肠道通透性。

随着现代医学的发展，越来越多的临床和实验研究证实，中药与肠道微生态密切相关，对人体的生理和代谢功能起着重要的作用［8-10］。人类肠道内的菌群不仅调节肠道活动，还影响宿主的大脑功能和行为［11-12］。胃肠道和中枢神经系统之间存在相互作用，即微生物-肠道-大脑轴在功能上存在联系［13］。肠道菌群的不平衡可能导致肠道大脑疾病和中枢神经系统疾病［14-15］。由于中枢神经系统与睡眠之间的联系，所以睡眠与肠道菌群之间也可能存在相关性。

灵芝是常见的中药材，富含有多糖、蛋白质、萜类、甾醇、生物碱和多肽类化合物，其中水溶性多糖和醇溶性三萜类是主要的生物活性成分。无柄灵芝（Ganoderma resinaceum）是灵芝属的一个种，已较早就被用于预防和治疗各类疾病，包括抗癌、保肝护肝等［16-18］。有研究表明灵芝可以减少自发的运动活动，放松中枢神经，延长非眼球快速运动睡眠［19-20］，还可以通过调节γ-氨基丁酸A型受体基因的表达来改善睡眠［21］。

灵芝多糖进入肠道中，与肠道菌群相互作用，被分解成小分子物质吸收［22］。灵芝酸A和皂苷类可改变大鼠肠道菌群组成；灵芝醇提取物可以提高瘤胃球菌的相对丰度比例，降低小鼠体内梭状芽胞杆菌的相对丰度比例，还能保护肠道黏膜完整性［23-24］，这为研究无柄灵芝对睡眠及肠道菌群的影响提供了依据。但是灵芝能否通过肠道菌群影响睡眠仍然未知，因此，本研究通过分析无柄灵芝醇提物（Ganoderma resinaceumalcohol extract，GRAE）对小鼠睡眠的作用，通过16S rDNA测序来检测分析GRAE处理组与空白对照组小鼠肠道菌群丰度的变化，进而探讨肠道菌群与睡眠之间可能存在的联系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 无柄灵芝醇提物的制备及成分分析 无柄灵芝子实体由福建农林大学菌物研究中心提供。选取栽培3个月且菌盖直径≥10 cm的无柄灵芝子实体，参照钟千贵等［25］的方法制备无柄灵芝醇提物，提取率为9.83%；经前期实验可知无柄灵芝醇提物总糖含量为48.77%，总三萜含量为25.37 mg/g，游离必需氨基酸总含量为45.542 mg/g，对ABTS、DPPH、羟基自由基清除率分别为 54.48%、24.42%、10.32%。

1.1.2 主要试剂 巴比妥钠为分析纯，购自北京岚泰化工科技有限公司。戊巴比妥钠为分析纯，购自北京华业寰宇化工有限公司。Phusion Hot Start Flex 2X Master Mix购自北京华夏远洋科技有限公司。E.Z.N.A.®Stool DNA Kit试剂盒试剂盒购自Omega Biotechnology公司。

1.1.3 实验动物 清洁级ICR雄性小鼠，体重（20±1）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号码：SCXK（沪）2017-0005。小鼠饲养在小鼠饲养笼内，控制环境温度为（24±1）℃，相对湿度为60%±10%，12 h间替的光/暗循环。实验前老鼠进行一周的适应性饲养，饲养期间老鼠自由进食。动物实验的操作严格遵循实验室动物使用指南，动物方案得到了福建农林大学食品科学学院动物护理与使用委员会的批准（FS-2019-0055）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及给药 参考《保健食品检验与评价技术规范》（2003版）稍作修改，选择40只体重偏差在2 g以内的小鼠，随机分为4组：对照组（CK，蒸馏水）、低剂量组（LDG，250 mg/（kg·bw）、中剂量组（MDG，500 mg/（kg·bw）和高剂量组（HDG，1 000 mg/（kg·bw）。每天上午9：00-10：00，通过灌胃给药，每天1次。根据小鼠的体重灌胃相应体积的药剂，剂量为0.2 mL/10 g·bw，连续灌服30 d。

1.2.2 睡眠实验 睡眠实验参照Yu等［26］的方法，戊巴比妥钠和巴比妥钠的浓度是经预实验验证的能引起小鼠睡眠的最低浓度。

戊巴比妥钠诱导下GRAE延长小鼠睡眠时间实验：各组小鼠在末次给药20 min后，腹腔注射戊巴比妥钠（55 mg/kg），注射量为0.2 mL/20 g，观察GRAE能否延长戊巴比妥钠睡眠时间。

戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验：各组小鼠在末次给药20 min后，腹腔注射戊巴比妥钠（32 mg/kg），注射量为0.2 mL/20 g，记录30 min内入睡小鼠数量。

巴比妥钠诱导下GRAE对小鼠睡眠潜伏期影响的实验：各组小鼠在末次给药20 min后，腹腔注射戊巴比妥钠（280 mg/kg），注射量为0.2 mL/20 g，观察在巴比妥钠诱导下GRAE对小鼠睡眠潜伏期的影响。

1.2.3 血清指标检测 持续给药30 d后，将小鼠禁食12 h，提供充足的水，眼球取血，离心收集血清，备用。测定血清中的血糖（glucose，GLU），甘油三酯（triglyceride，TG），血清总胆固醇（total serum cholesterol，TCHO），低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C） 的含量。

1.2.4 16S rDNA测序鉴定小鼠肠道菌群及功能分析 收集小鼠粪便样品，采用干冰送样的方法送至杭州联川生物技术股份有限公司进行测序。根据公司反馈的高质量的clean标签。使用Vsearch软件（v2.3.4）对嵌合序列进行过滤，用QIIME2进行Beta多样性分析，R包绘制图。最后采用BLAST进行序列比对，每个代表性序列用SILVA数据库对特征序列进行注释，用生物信息学方法对结果进行了分析［27］。

1.2.5 统计学分析 实验数据统计分析使用SPSS 16.0，并使用GraphPad Prism 6进行绘图。所有数值以平均值±SD表示。每组实验设计为3个平行，实验结果采用单因素方差分析（one-way ANOVA），P< 0.05的差异被认为是显著的。

2 结果

2.1 GRAE对小鼠体重的影响

由表1可知，与空白组相比，无柄灵芝低、中、高剂量组均不存在显著性差异（P> 0.05），但随着给药天数的增加体重差异越来越明显。实验组中随着给药剂量的增加小鼠体重有递减趋势，实验组间不存在显著性差异。说明GRAE对小鼠的体重的增长没有明显影响。

表1 无柄灵芝醇提物对小鼠的体重的影响Table 1 Effects of GRAE on the body weights of mice

2.2 无柄灵芝醇提物改善小鼠睡眠能力分析

小鼠在给药后均未出现入睡现象，但出现活动减少现象；CK组的小鼠在灌胃同等体积的蒸馏水后，活动正常，无任何安静和减少活动的现象。由此可知，无柄灵芝醇提物对小鼠没有直接睡眠的作用，但有一定的安眠镇神的作用。GRAE对小鼠没有直接睡眠作用，根据《保健食品检验与评价技术规范》（2003版），可以使用戊巴比妥钠和巴比妥钠诱导小鼠睡眠进行下一步实验。

由表2可知，在戊巴比妥钠（55 mg/kg）的催眠下，LDG组的小鼠睡眠时间与空白组的相比不具有显著性差异（P>0.05），MDG和HDG组的小鼠睡眠时间与CK组相比存在极显著性差异（P<0.01）。在戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验中，随着给药剂量的增加，入睡小鼠的只数增多，入睡率增加。在巴比妥钠（280 mg/kg）对小鼠睡眠潜伏期的研究中，随着给药剂量的增加，小鼠的睡眠潜伏时长呈递减的趋势。与CK组对比，LDG和MDG组虽然睡眠潜伏期有缩短，但不具有显著差异性；HDG组的睡眠潜伏期与空白组相比，具有显著的减少（P<0.01）。根据《保健食品检验与评价技术规范》（2003版）可判定，GRAE（1 000 mg/kg·bw）有改善睡眠的功能。

2.3 GRAE对小鼠血清的影响

由图1可知，与CK组相比，HDG组的血糖和甘油三脂均极显著下降（P<0.01），血清总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇均无显著性差异，但有一定的下降趋势。

图1 持续给药30 d后小鼠的血清指标变化Fig.1 Changes of serum indexes in mice after 30 d of continuous administration

2.4 16S rDNA测序数据

由公司对原始数据进行双端拼接、质量控制、嵌合体过滤后，获得有效数据（clean data），进行统计分析，结果见表3。由表3可知，有效数据都在80%以上，可以有效满足后续的实验分析。

表3 有效数据统计Table 3 Effective data statistics

2.5 小鼠肠道菌群的feature分析

Feature是经过去除背景噪音获得的特征序列。通过对Feature的Venn图分析，CK组独有的feature有1 294个，HDG组独有的feature有1 663个，两组共有的feature有1 053个（图2）。

图2 两组样本的韦恩图Fig.2 Venn diagram in two groups of samples

2.6 Alpha多样性分析和beta多样性分析

本研究采用Chao1和Observed_species估计小鼠肠道菌群中包含物种的数目，Shannon和Simpson指数来评估物种的均匀度和丰富度，Goods _coverage反映样本的测序深度。由表4可知，CK组和HDG组的Coverage指数都是0.908，表明该次样本测序结果可代表样本的真实情况。与CK组相比，HDG组的Observed_species、Chao1、Shannon和Simpson指数均出现不同程度的降低。PCA分析结果表明HDG与CK组的肠道菌群结构组间差异大。PCA分析结果表明HDG与CK组的组间差异明显，说明GRAE对小鼠肠道菌群的多样性有影响（图3）。

图3 PCA分析比较组间差异Fig.3 Difference between PCA analysis and comparison groups

表4 各组小鼠粪便样品中α多样性的指数Table 4 Alpha diversity index of each group in fecal samples

2.7 小鼠肠道菌群分类学组成分析

对小鼠肠道菌群的16S rDNA测序结果进行分类学组成分析，总共注释到19个门、43个纲、65个目、107个科、185个属、213个种，根据注释结果选取门、属水平菌群丰度排名前20 feature生成堆叠图。在门水平上（图4-A），CK组和HDG组的优势菌群均为拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、变形杆菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）。与CK组相比，HDG组中厚壁菌门、变形杆菌门、脱铁杆菌门的菌群丰度有所下降；拟杆菌门和放线菌门的菌群丰度有所增加。在属水平上（图4-B），CK组和HDG组的优势菌群主 要 集 中 在Porphyromonadaceae、Lachnospiraceae、Desulfovibrio、Alistipes和Ruminococcus属。与CK组相比，HDG组中脱硫弧菌属（Desulfovibrio）、Alistipes属、乳酸菌属（Lactobacillus）的菌群丰度有所下降，Porphyromonadaceae、Ruminococcaceae、双歧杆菌属（Bifidobacterium）的菌群丰度有所增加。

图4 群落结构分布图Fig. 4 Distribution of community structure

进一步将HDG与CK组的数据进行显著性差异分析，结果如图5所示，在属水平上，与CK组相比，HDG组的菌群丰度具有显著性差异（P< 0.05）变化的菌群有5个，分别为Rikenellaceae、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、Proteobaceria、醋杆菌属（Acetobacterium）、丙酸杆菌属（Propionibacterium），这5个属的菌群的丰度均表现为降低。

图5 差异菌群显著性分析（CK vs HDG）Fig.5 Significance analysis of differential microbiota（CK vs HDG）

3 讨论

小鼠睡眠实验结果显示，GRAE（1 000 mg/kg·bw）可以延长戊巴比妥钠诱导下小鼠的睡眠时间，增加戊巴比妥钠阈下剂量催眠下小鼠的睡眠率，并缩短巴比妥钠诱导下小鼠的睡眠潜伏期。这些结果表明，GRAE能延长小鼠睡眠时间，该结果为开发改善睡眠的功能性健康产品提供了依据。血清指标结果表明，改善睡眠后小鼠的血糖和甘油三脂含量显著下降。黄曙文［28］研究证明血清中的甘油三脂含量过高，会影响神经递质的释放，产生抑郁情绪障碍，进而影响入睡，与本文结果相符。

肠道微生物群与大脑之间存在双向关系，通常称为微生物群-肠-脑轴，该轴在调节脑功能和行为中起关键作用。在肠道菌群影响情绪的过程中，微生物代谢物可能起重要的作用，一些细菌能够产生与动物神经系统中相同的神经调节物质，包括γ-氨基丁酸、乙酰胆碱、多巴胺、血清素和去甲肾上腺素［29］。睡眠深受大脑调节，情绪的变化也会对睡眠质量产生影响。本研究的16S rDNA测序结果表明，CK组与HDG组的肠道菌群丰度都存在差异。小鼠肠道菌群分类学组成分析表明，GRAE能使拟杆菌门和放线菌门的菌群丰度增加。李云等［30］研究发现剥夺睡眠后大鼠的肠道菌群中的拟杆菌门丰度减少。这与本文中，GRAE可能通过调节小鼠肠道中拟杆菌的丰度进而对小鼠睡眠产生影响的结果相符。此外，菌群分类学组成分析还表明，GRAE能增加双歧杆菌属的菌群丰度，降低乳酸菌属的菌群丰度。双歧杆菌属是人类的益生菌，能改善肠道菌群的平衡，促进营养吸收，具有良好的预防疾病作用［31］。任晓宇等［32］研究表明，剥夺睡眠后，小鼠粪便中双歧杆菌显著减少。双歧杆菌可减少了动物模型中的焦虑行为，增加REM 睡眠持续时间，恢复了产前应激动物的睡眠结构［33］。乳酸菌可通过生成γ-氨基丁酸影响中枢神经系统，从而改善睡眠模式和质量［34］。因此可以推测，GRAE可能通过调节小鼠肠道拟杆菌门、双歧杆菌和乳酸菌的丰度，进而改善小鼠睡眠。

属水平上的显著性分析表明，GRAE使克雷伯氏菌属的菌群丰度显著性下降。克雷伯氏菌主要存在人和许多动物的呼吸道以及消化道中，可导致肺炎、支气管炎、脑膜炎等疾病［35］，是一种有害菌。已有研究表明，肠道微生物诱发的炎症明显存在精神分裂症、重度抑郁症和双相情感障碍等精神疾病的患者中［36］。这些精神疾病均会导致患者发生不同程度的睡眠障碍。因此，可推测GRAE可能通过减少克雷伯氏菌属的丰度，预防由小鼠肠道中有害菌引起的炎症，从而间接地改善睡眠质量。

4 结论

GRAE可能通过调节肠道中的拟杆菌、双歧杆菌、乳酸菌和克雷伯氏菌的丰度影响小鼠睡眠。尽管还需要进一步的研究来确定无柄灵芝中能够改善睡眠和调节肠道菌群的活性成分，但这项研究为今后研究无柄灵芝的功能和作用机制提供了数据支持。