农业转基因核酸标准物质研究进展

林鹰 杨文莉 周玲艳 姜大刚

（1. 仲恺农业工程学院农业与生物学院，广州 510225；2. 华南农业大学生命科学学院，广州 510642）

近年来，转基因作物发展迅猛，种植面积不断扩大。转基因农作物能满足人类对于农产品产量和质量不断增长的要求，为消费者提供更多选择［1］。我国已经批准转基因棉花和转基因番木瓜的商业化生产，创造了巨大的经济效益和生态效益。转基因技术产生以来，国际食品法典委员会（Codex Alimentarius Commission，CAC）、联合国粮农组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）、世界卫生组织（World Health Organization，WHO）等针对转基因技术产品安全问题制定了一系列转基因生物安全评价标准，我国也建立了比较完善的农业转基因生物安全标准体系［2］。为保障转基因产品成分的检测结果准确一致，需要设置标准物质对照样品［3］。

标准物质（reference material，RM）是一种已经确定了具有高度均匀性、良好稳定性和量值准确性等特性值的物质或材料。其均匀性和稳定性的特性，有利于在特性检测或测量中进行使用评估［4］。因此，农业转基因检测标准物质的研制和使用，可以保证农业转基因产品检测结果的有效性和可比性，为农业转基因产品定性和定量检测提供保障，也是解决转基因产品准确检测的基础［5］。鉴于农业转基因检测标准物质的重要性，本文对转基因农作物标准物质的研究进展进行了总结，并对几种主要类型的标准物质进行比较，同时，梳理了转基因检测标准物质研制中所存在的问题，并就研究现状和存在问题提出建议与对策，以期为我国农业转基因检测标准物质研制和相关研究提供参考。

1 国内外农业转基因检测标准物质研究概况

转基因作物商业化应用已经25年，各国农业转基因检测标准物质的研制也在不断增加，主要有美国油脂化学家学会（American Oil Chemists’ Society，AOCS）和欧盟联合研究中心（Joint Research Center，JRC），除此之外，还包括日本国立食品综合研究所（National Food Research Institute，NFRI）和 墨西哥国家计量院（The National Center of Metrology，CENAM）等［6］。美国AOCS的农业转基因检测标准物质在售的类型包括油菜、棉花、玉米、水稻和大豆这五类，有证标准物质共63个，包括60个转化体。欧盟JRC在售的转基因农作物标准物质包括油菜、棉花、玉米、马铃薯、大豆和甜菜这六类，有证标准物质有37个转化体，包括146个农业转基因检测标准物质（图1、2）。欧盟JRC有二十几个转化体具有一套不同含量的转基因检测标准物质，例如，“Bt-176 MAIZE”基因组DNA标准物质具有0、0.1%、0.5%、1%、2%、5%、100%含量的7个转基因检测标准物质，“Bt11 MAIZE”基因组DNA标准物质具有0、0.1%、1%、10%、100%含量的5个转基因检测标准物质。

图1 三大经济体转基因作物有证标准物质数量及包含的转化体个数Fig.1 Number of certified reference materials and involved transgenic crop events of three major economies

图2 三大经济体主要转基因农作物的有证标准物质数量Fig.2 Number of certified reference materials of genetically modified crops in three major economies

2008年起，我国开始进行转基因检测标准物质的研制，并且成功研制出一批农业转基因检测标准物质［7］，研制单位主要有中国计量科学研究院、中国农业科学院以及农业农村部科技发展中心等。目前，在我国国家标准物质资源共享平台（National Sharing Platform for Reference Materials，China）上，可以查询到农业转基因标准物质有27个转化体（图1）。在这些标准物质中，有7种转化体具有不同含量的转基因检测标准物质，如“转基因BT63水稻种子粉末”和“转基因克螟稻2号水稻种子粉末”都具有0.5%、1.0%、2.0%、5.0%含量的4个转基因检测标准物质。

在已经商业化或具有商业化前景的转基因作物中，抗虫和耐除草剂性状占据绝大部分比例。我国已经获批的转基因检测标准物质与美国AOCS和欧盟JRC的情况类似，主要是抗虫和耐除草剂性状（表1，2）。我国的研制对象主要是油菜、棉花、玉米、水稻和大豆这5种转基因作物，例如转基因棉花［8］、转基因玉米NK603［9］、转基因水稻［10］、转基因大豆pMON87712［11］等。美国AOCS和欧盟JRC的研制对象也主要是水稻、玉米、大豆、棉花等农作物。标准物质研究类型方面，我国与美国AOCS以及欧盟JRC有所区别，美国AOCS的转基因检测标准物质种类主要有基体和基因组DNA转基因检测标准物质，其中基体类型达到了40种；欧盟JRC主要研制基因组DNA转基因检测标准物质，数量达到了30种，也有少量的质粒和基体转基因检测标准物质；我国农业转基因检测标准物质主要以质粒和基体转基因检测标准物质类型为主，也有部分基因组DNA转基因检测标准物质（图3）。

表1 美国与欧盟部分农业转基因检测标准物质Table 1 Certified reference materials of agricultural genetically modified crops in United States and European Union

图3 三大经济体农业转基因有证标准物质的种类Fig.3 Certified reference materials types of agricultural genetically modified crops in three major economies

2 我国农业转基因检测标准物质技术规范

近年来，越来越多的转基因检测标准发布执行，其中多个检测方法和技术规范与标准物质相关（表3）。2012年，农业农村部发布的转基因植物的检测方法及技术规范第1782号中有2项标准物质研制相关技术规范，分别为《转基因植物及其产品成分检测基体标准物质制备技术规范》和《转基因植物及其产品成分检测标准物质试用评价技术规范》。2015年，中华人民共和国农业部公告第2259号中有3项标准物质相关技术规范，包括《转基因植物及其产品成分检测基体标准物质定值技术规范》《转基因植物及其产品成分检测玉米标准物质候选物繁殖与鉴定技术规范》《转基因植物及其产品成分检测棉花标准物质候选物繁殖与鉴定技术规范》。2018年，中华人民共和国农业农村部公告第111号中有2项标准物质相关技术规范，包括《转基因植物及其产品成分检测基因组DNA标准物质制备技术规范》和《转基因植物及其产品成分检测基因组DNA标准物质定值技术规范》。2020年，中华人民共和国农业农村部公告第323号中有4项标准物质相关技术规范，包括《转基因植物及其产品成分检测油菜标准物质原材料繁殖与鉴定技术规范》《转基因植物及其产品成分检测大豆标准物质原材料繁殖与鉴定技术规范》《转基因植物及其产品成分检测质粒DNA标准物质制备技术规范》《转基因植物及其产品成分检测水稻标准物质原材料繁殖与鉴定技术规范》。以上标准物质有关的标准涉及了标准物质的基本概念、候选物的繁殖、制备技术流程等。相关规范的不断出台，促进和规范了我国农业转基因检测标准物质的快速研制。

表3 我国部分农业转基因检测标准物质技术规范Table 3 Some technical specifications of agricultural genetically modified testing reference materials in China

3 农业转基因检测标准物质种类与研制

目前，已经获批的农业转基因检测标准物质种类主要有基体标准物质［12-13］、质粒标准物质［14］、基因组DNA标准物质［15］三类。由于其原料选择不同，标准物质研制的方法和过程也不同，具有不同的优缺点（表4）。

表4 3种农业转基因检测标准物质的区别Table 4 Comparison of three agricultural genetically modified testing reference materials

农业转基因基体标准物质是由纯合的非转基因作物种子与纯合的转基因作物种子，按照一定的质量比例混合制备而成。与待测样品具有相同或者相似的特性，检测结果不需要矫正，结果稳定可靠。基体标准物质量值范围广，在实际检测中可在0-100%之间，其适用性也较广，可以进行核酸或蛋白质检测，但由于原料的特殊性，在制备基体标准物质时需要测定种子的颗粒大小、含水量和基体粉末质量分数等［16］。多个研究课题组报道了基体标准物质的研制，如转基因玉米MIR604［17］和转基因大豆MON89788［18］等。基体标准物质有其突出优点，但也存在不足，比如成本较高，对原料要求与鉴别高于其他两种标准物质种类，且一种基体标准物质只能用于一种作物的检验。

农业转基因质粒标准物质是通过构建一个具有外源目的片段和内源标准基因片段的重组质粒DNA分子，以用于检测转基因DNA的标准物质。质粒标准物质可用于检测多个靶标的转化体［19］，且比基体标准物质更方便［20］；在制备质粒标准物质时，可以通过细菌的大量培养达到大量繁殖的效果，从而有效解决阳性标准品制备困难的问题，且成本低廉，操作简便［21］；另外，由于构建的质粒是含有目的片段的重组质粒分子，因此转基因质粒标准物质纯度高，均匀性好，可以进行高通量检测，不依赖转基因原材料限制。已有多个质粒标准物质制备的报道，如转基因油菜［22］、转基因棉花［23］、转基因大豆质粒标准物质［24］、转基因水稻克螟稻2号［25］。在质粒标准物质研制过程中，需要对质粒进行DNA抽提、纯度鉴定、适应性鉴定等，在定值时需测定外源与内源参考基因的拷贝比值和拷贝数浓度。这与待测样品的基因组DNA抽提过程和获得的DNA结构并不是完全一致的；同时，质粒标准物质分子较小，在使用中容易造成实验室污染，质粒分子的定值误差也较大，对结果的影响较大［26］。

农业转基因基因组DNA标准物质是以提取农作物的基因组DNA而制备。已经报道的转基因基因组DNA标准物质有转基因水稻科丰6号［27］、转基因水稻KMD［28］、转基因水稻G6H1、转基因玉米双抗12-5等（表2）。在标准物质制备时，需要进行转基因农作物基因组DNA抽提以及基因组DNA质量评价。基因组DNA的制备过程决定了其具有质量高、结构稳定的特点。但基因组DNA标准物质不能用于蛋白质的检测，且制备时需要抽提大量的DNA，同时对制备DNA的原料要求也比较高。

表2 我国的部分农业转基因作物有证标准物质Table 2 Some certified reference materials of agricultural genetically modified crops in China

以上3种类型的转基因检测标准物质的研制均包括原料提取纯化、性质的初步表征、分装、适应性验证、均匀性和稳定性检验、不确定度测算［29］、定值以及申报等过程。其中，性质的初步表征主要是对转基因农产品的基因型、性质、转基因片段以及纯度进行测定，同时需要对已知标准物质的不确定度进行测算等［30］。在研制农业转基因检测标准物质时，定值方法非常重要，其不仅在定值过程中发挥重要作用，同时，在性质的初步表征、均匀性和稳定性检验、不确定度评估中同样发挥重要作用。因此，研发者需要对定值方法进行优化，也需要有方法学参数等校准系统作为支撑，从而通过方法重复性、重现性、灵敏度等方面的数据验证，以保证定值方法的可靠性以及研制定值结果的说服力［31］。在评估不确定度时，应考虑到各种检测定值方法引起的不确定度，以保证标准物质的准确性和可追溯性［32-33］。

目前，对农业转基因检测标准物质的定值方法主要包括实时荧光定量PCR和数字PCR方法两种，其中数字PCR由于其具有的绝对定量的优越性，得到越来越多的应用。数字PCR是将单个DNA样品反应液分别进行数以万计的反应和扩增检测，是一种基于PCR的单分子绝对定量技术［34］。与实时荧光PCR不同，数字PCR在农业转基因检测标准物质定值中，不需要依赖对照样品和标准曲线，即可直接对核酸拷贝数的绝对量值进行检测，具有灵敏度和准确性更高的特点，成为目前主要的定值技术［35］。但是，数字PCR技术也存在着成本高、自动化和集成度水平低、分析通量低、兼容性差等问题［36］，并且作为一种新型技术，标准体系还需要进一步的完善。因此，完善数字PCR标准体系建设和积极推动数字PCR标准的国际化，对农业转基因检测标准物质的研制具有重要意义。

4 我国农业转基因检测标准物质研制中存在的问题

我国农业转基因检测标准物质的研制起始时间滞后于欧美发达国家，近些年来奋起直追，取得了巨大的进步。但我国转基因检测标准物质的研制尚存在以下几个主要问题：

首先，获得批准的转基因检测标准物质数量较少。至2019年，我国已经批准5种转基因作物用于进口加工原料，同时，还有批准种植的农作物如棉花等，但在国家标准物质资源共享平台上可查询到的、获批的转基因检测标准物质数量只有46个。因此，加快对转基因检测标准物质的研制和申报迫在眉睫。

其次，获批的标准物质大部分以基体或者质粒类型为主，如转基因马铃薯标准物质［37］。同时，标准物质以水稻为主，而大量进口的转基因玉米和大豆转化体则相对较少。因此，应通过多种形式拓宽标准物质的研制种类和范围，以满足转基因产品的检测需求，保证转基因农产品安全使用。

最后，转基因检测标准物质由于价格问题，在实际的检测工作中应用不够广泛，作用发挥不够到位。因此，需要政府管理部门主导农业转基因检测标准物质的研制，并与国际接轨，通过国际比对和各国协同定值，进一步发挥转基因检测标准物质作为分析检测转基因农产品的物质基础和质量管理工具，保障贸易安全，保护经济利益［38］。

5 展望

农业转基因检测标准物质的研制，是农业转基因产品定性与定量检测中不可或缺的评量物质，为转基因农作物检测提供保障，其制备技术和应用程度能够直接反应转基因农产品检测技术体系的水平以及转基因农产品检测准确度的可靠性。随着国家对转基因检测标准物质研制的重视，以及转基因检测标准物质在检测工作中的推广使用，转基因检测标准物质的作用也将得到更好的发挥，更好的为我国生物育种发挥保障作用。因此，更准确、方便实用的转基因检测标准物质，必将更加有利于促进农业转基因产业的更优发展。