植物胁迫相关microRNA研究进展

王楠楠 王文佳 朱强

（福建农林大学林学院，福州 350000）

miRNA是一种植物体内广泛存在的内源性非编码RNA。1993年，Lee等［1］在秀丽隐杆线虫中首次发现动物miRNA lin-4，随后在2002年，Reinhart等［2］在拟南芥中也发现了16条miRNA。随着高通量测序和生物信息技术的迅速发展，越来越多miRNA被发 现，截 至2019年，miRBase（http://mirbase.org/）已经收录了来自271个物种的38 598条miRNA前体和48 860条成熟体［3］。近年来，越来越多的研究表明miRNA在植物的诸多生物学过程中都起着重要作用，其中miRNA在植物生长发育过程中的重要作用已经由前人较为详细的总结［4-5］。本文侧重阐述挖掘miRNA在植物胁迫响应过程中的作用。

1 miRNA的产生及作用方式

1.1 miRNA的产生

miRNA的基因（MIR）被RNA聚合酶II（Pol II）转录成具有茎环结构的初级miRNA（pri-miRNA）。pri-miRNA在RNase III家族酶DICER-LIKE1（DCL1）的作用下加工形成miRNA/miRNA*双链体。双链体的3'端被甲基转移酶HUA ENHANCER1（HEN1）2'-O-甲基化。之后，双链体中的一条链被整合到ARGONAUTE1（AGO1）中以形成RNA诱导的沉默复合物（RISC）。以下将详细介绍miRNA复杂的产生过程。

1.1.1MIR转录与转录调控 Mediator作为一种通用的转录共激活因子，有助于将Pol II募集到MIR基因座［6］。还存在一些其他帮助MIR转录的蛋白，包括NEGATIVE ON TATA LESS2（NOT2）、含有MYB结构域的DNA结合蛋白CELL DIVISION CYCLE 5（CDC5）和被认为有助于转录延伸的Elongator复合物［7-9］。NOT2、CDC5和Elongator都 与Pol II以 及miRNA前体加工复合物相互作用。MIR转录中的Pol II活性还受到磷酸化调节［10］。

1.1.2 miRNA前体加工 pri-miRNA由包含DCL1、HYPONASTIC LEAVES1（HYL1）和SERRATE（SE）作为核心成分的切割复合物加工，以产生成熟的miRNA/miRNA*双链体［11］。DCL1起到剪切的作用，将pri-miRNA剪切成21-nt的miRNA/miRNA*双链体，HYL1与DCL1相互作用以促进有效和精确的primiRNA的加工［12］。SE被认为是拟南芥miRNA加工复合体的核心成员，SE突变导致成熟miRNA水平降低、pri-miRNA水平增加以及pri-miRNA剪切缺陷［13］。

1.1.3 miRNA稳定化和RISC形成 miRNA/miRNA*双链体的3'-末端被HEN1 2'-O-甲基化以稳定。HEN1最初是在拟南芥中作为甲基转移酶被发现的，它可以特异性地甲基化小RNA［14］。拟南芥HEN1-small RNA复合物的晶体结构表明小RNA双链体与HEN1双链RNA结合域（dsRBD）结合，其中一个末端位于甲基转移酶（MTase）活性位点并依赖于Mg2+甲基化［15］。

随后，miRNA双链体的一条链被选为引导链，而另一条链则被降解。RISC的形成包括4个部分。第一步，AGO1和HEAT SHOCK PROTEIN 90（HSP90）的二聚体形成复合物。第二步，三磷酸腺苷（ATP）与HSP90的结合引起AGO1构象变化，从而允许双链体结合到AGO1-HSP90蛋白复合物中。第三步，ATP水解诱导HSP90从AGO1解离。最后，HSP90解离引起的AGO1构象变化去除非引导链并形成成熟RISC［16］。

目前尚不清楚miRNA是否在RISC形成之前被输送至细胞质。在早期模型中，miRNA/miRNA*双链体通过HASTY运输至细胞质，然后装载到AGO1上［17］。然而，最近提出了另一种模型，即AGO1的装载发生在细胞核中［18］。

1.2 miRNA的作用方式

植物miRNA通过两种主要机制在转录后水平调节靶基因：mRNA的剪切和翻译抑制［19］。在植物中，miRNA与靶标mRNA具有近乎完美的互补性，因此，对转录本剪切被认为是植物miRNA的主要作用方式。然而，这是一种误解。虽然高度互补的序列有利于对mRNA的切割，但它也同样发挥翻译抑制的作用。事实上，经过实验验证，靶基因也会经历miRNA介导的翻译抑制［20］。除了mRNA切割和翻译抑制外，一些miRNA还触发一些特殊靶基因转录本产生次级siRNA（phasiRNAs），成熟的phasiRNA通过碱基互补配对原理在转录后水平发挥负向调控作用，这是植物中普遍且保守的现象［21］。

2 miRNA参与胁迫响应

研究表明，miRNA在多种生物学过程中起着重要的调节作用，包括植物的发育、代谢、非生物胁迫以及病原体防御等过程（图1）。环境胁迫能诱导植物在表型和生理生化上产生一系列的变化以适应其正常生长，例如在表型上调整植株的大小、叶片大小及卷曲程度、根的生长情况、气孔开合以及细胞大小等；生理生化上表现在次级代谢物积累、光合作用的抑制、呼吸作用的加强以及一些抗氧化酶的激活等。并且为了适应环境，植物也进化出各种抗逆机制，例如脱落酸（abscisic acid，ABA）合成、活性氧（reactive oxygen species，ROS）清除、离子平衡、乙烯反应和调节下游防御反应的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径等。探究miRNA在植物响应环境胁迫过程中的分子机制，有利于未来利用基因工程技术提高植物抗性、改良植物品质。

图1 miRNA在胁迫响应过程中的作用Fig. 1 Role of microRNA in plant stress responses

2.1 非生物胁迫

2.1.1 干旱胁迫 干旱是决定植物生产力和分布的重要环境因素之一。miR156是植物中最早被发现的一种miRNA，它与SQUAMOSA-promoter binding like（SPL）转录因子的相互关系在植物中普遍保守。玉米miR156在烟草内过表达能提高转基因植物的抗旱性，进一步研究表明，抗旱性的提高与脯氨酸等次级代谢物的积累以及抗氧化酶表达量升高有关［22］。番茄miR159也可通过调节MYB33的转录水平诱导脯氨酸和腐胺的积累从而帮助植物提高抗旱性［23］。花青素作为一种次级代谢产物通过清除ROS以保护植物免受胁迫。在拟南芥、水稻、紫花苜蓿以及杨树中，都存在miR156/SPL通过调节花青素的积累水平响应植物干旱胁迫的机制［24-26］。其中，苜蓿SPL13可以直接与编码花青素生物合成过程关键酶基因DIHYDROFLAVONOL-4-REDUCTASE（DFR）的启动子区域相结合调节其表达。

1.1.1纳入标准 （1）有高血压病史，或者正在服用降压药者。（2）明显心律不齐或者心房颤动者。（3）血脂异常者。（4）吸烟者。（5）无体育运动者。（6）糖尿病者。（7）BMI（身体指数）在26kg/m2以上者。（8）有脑卒中家族史者。

气孔是植物叶片表皮中的“窗口”，在植物与环境之间的气体交换中起核心作用，气孔的开关受环境信号和内源性激素调节进而影响植物对干旱胁迫的反应和耐受性。而ABA作为一种内源性植物激素，是调节水分流失和气孔开合的关键激素。有研究表明Auxin response factors 10（ARF10）作为miR160的靶基因通过影响气孔开合进而参与番茄干旱胁迫过程，35S∶mSlARF10转基因番茄表现出叶片变窄、气孔变大等表型，SlARF10不仅影响ABA合成，而且也影响气孔发育和水通道蛋白基因（AQPs）表达，这两者协同作用可以控制番茄叶片水分的流失［27］。miR393-OE（miR393 overexpressing transgenic line）表现出气孔密度的增加以及保卫细胞长度的减少，而缺失型突变体表现出相反的表型，这可能与miR393靶基因ARF5以及气孔发育相关基因EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 1（EPF1）、SPEECHLESS（SPCH）以及MUTE的沉默有关。miR393-OE对干旱处理更为敏感，能积累多于野生型的丙二醛（malondialdehyde，MDA）和过氧化氢（H2O2），同时还能抑制ABA在叶片的积累。这些结果也证明了miR393通过与ABA之间的相互作用以及调控气孔密度从而响应植物干旱胁迫［28］。Zhao等［29］构建的过表达Osa-miR393a的转基因匍匐翦股颖表现出与气孔密度和表皮致密相关的干旱胁迫耐受性的增强，还确定了miR393的两个靶标Auxin signalling F-BOX 2（AsAFB2）和TRANSPORT INHIBITOR RESPONSE 1（AsTIR1）。独脚金内酯是植物地上部分适应干旱胁迫所需的一种植物激素。对番茄施加外源的独脚金内酯诱导miR156的积累，miR156-OE和独脚金内酯的处理都会使植物气孔导度降低以及ABA敏感性增加［30］。而miR398c却负向调控大豆的抗旱性，过表达miR398c通过下调过氧化物酶体相关基因（GmCSD1a/b、GmCSD2a/b/c和GmCCS）的表达削弱其清除ROS的能力，引起电解质泄漏和气孔打开［31］。

植物通过表型的改变以适应干旱胁迫，例如改变根构型以更好的吸收土壤中的水分、调整叶片大小及卷曲程度以减轻水分蒸发等。研究人员在拟南芥中鉴定出miR167的新靶点IAA-Ala Resistant 3（IAR3），IAR3具有将非活性形式的生长素水解并释放出活性形式的功能。干旱胁迫下miR167表达量下降导致IAR3积累从而提高生长素（auxin）水平以促进侧根生成［32］。Yang等［33］在拟南芥中研究了miR160和miR165/166之间的相互作用及其对拟南芥叶片发育和耐旱性的影响。发现STTM160莲座叶呈现明显的锯齿状，STTM165/166呈现出严重的向上卷曲，而STTM160×165/166呈现出轻微的向下卷曲。研究结果还显示，miR160指导ARF通过生长素信号途径促进叶片发育，而miR165/166介导的HD-ZIP IIIs通过ABA信号途径赋予植物耐旱性。在干旱胁迫下，异源表达OsmiR408的转基因黑麦草与野生型相比，表现出叶片卷曲、气孔凹陷等表型，这与其保持较高的叶片相对含水量、较低的电解质渗透率和较少的脂质氧化相关，使转基因植株表现出更强的抗旱能力［34］。

2.1.2 盐胁迫 土壤盐碱化是植物面临的一种非常普遍的非生物胁迫，它影响了世界上约6%的土地和23%的耕地。盐碱化严重影响了作物的生存环境和产量，造成了相当大的经济损失。植物受到盐胁迫会显著影响多种内源性信号分子的水平，包括ABA、乙烯、赤霉素（gibberellin，GA）、ROS、一氧化氮（NO）等。这些信号分子及其下游信号成分已被证明在植物盐胁迫响应中发挥着重要作用。拟南芥miR394及其靶基因LEAF CURLING RESPONSIVENESS（LCR）将ABA与盐胁迫响应联系起来。miR394受ABA诱导而积累，LCR则相反。盐胁迫实验表明miR394作为植物盐胁迫响应的负调节因子，过表达促进ABA引起的气孔关闭、ROS的积累以及ABA响应基因的表达［35］。过表达Sm-MIR408的转基因烟草则能在促进种子萌发的同时减少盐胁迫下ROS的积累，并且增强抗氧化基因的转录水平及其酶活性［36］。乙烯信号途径主要通过调节ROS产生和ROS清除机制来响应盐胁迫反应。Liu等［37］在柳枝稷耐盐性实验研究中发现，miR319-OE转基因柳枝稷通过抑制靶基因PvPCF5的表达进而下调蛋氨酸循环中关键基因的表达，从而促进乙烯合成相关基因表达以提高耐盐性。

在研究匍匐剪股颖植物响应盐胁迫的分子机制时发现，过表达Osa-miR528的转基因匍匐翦股颖节间缩短、分蘖数增加，通过改善植物保水性、细胞膜完整性、叶绿素含量，维持钾离子稳态、过氧化氢酶活性以及降低抗坏血酸氧化酶（ascorbic acid oxidase，AAO）活性而提高植物对盐胁迫的耐受性［38］。过表达Osa-miR393a的转基因匍匐翦股颖通过正向调控离子转运相关基因（AsNHX1）的表达，促进转基因植物钾离子的吸收以达到耐盐性增强的作用［29］。Yuan等［39］对miR396与耐盐性之间机制进行研究时发现，Osa-miR396c转基因植物与野生型相比，表现出生物量减少、节间减短、叶片面积减少、叶脉数量减少、单位面积表皮细胞减少的表型，而在高盐胁迫下表现出保水性增强、叶绿素含量增加、细胞膜完整性高和钠离子外排增强等耐盐性等表型。WRKY转录因子通过参与ABA合成、ROS清除、离子平衡和乙烯反应途径参与盐胁迫耐受相关的生物学途径以保护植物免受盐胁迫损害。然而关于WRKY上游的调控机制尚未可知。近期在苹果盐胁迫与miR156的研究中发现，miR156-OE减弱植物耐盐性，其靶基因SPL13的过表达能增强耐盐性，同时揭示了SPL13直接与WRKY100相互作用以增强植物耐盐性［40］。

2.1.3 低温胁迫 低温胁迫通过影响光合作用、呼吸作用以及ROS的产生和积累而对植物产生一系列负面作用。miR319已被证明可靶向TEOSINTE BRANCHED/CYCLOIDEA/PCF（TCP）转 录 因 子，TCP基因家族是高等植物特有的转录因子，这类转录因子通过控制细胞增殖以参与调节植物生长发育的多个过程，它们的特征是在N末端具有高度保守的59个氨基酸构成的TCP结构域。OsamiR319的表达受低温诱导下调，其靶基因OsPCF6和OsTCP21则相反。Osa-miR319过表达导致植物对低温胁迫耐受性增强，这可能与脯氨酸的积累、OsPCF6和OsTCP21调 节 的ROS的 清 除 以 及以一些低温响应基因表达量升高有关［41］。在甜瓜中，低温诱导miR319c表达量降低，引起TCP2介导的ELONGATED HIPOCOTYL 5（HY5）水平增加，HY5转录因子通过调节花青素生物合成途径中关键成分积累从而响应低温胁迫［42］。番茄miR319d过表达也增强其冷胁迫耐受性，具体表现在电解质渗透率、MDA浓度、O2-浓度和H2O2浓度的降低以及叶绿素含量和Fv/Fm值的增高，这可能与FeSOD、CuZnSOD和过氧化氢酶（CAT）基因表达水平升高以及GAMYB-like1表达水平降低有关［43］。

OsmiR528过表达增强了拟南芥、松树和水稻的冷胁迫耐受性。OsmiR528通过靶向F-box进而降低转录因子OsMYB30的表达。据报道，OsMYB30促 进β淀 粉 酶（β-amylase，BMY）基 因OsBMY2、OsBMY6和OsBMY10表达从而增加细胞中糖含量以增强植物冷胁迫耐受性［44］。香蕉miR528在冷胁迫下显著下调，其靶基因多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）基因的表达量则上调100倍以上，这引起ROS含量激增，使得香蕉果实果皮褐变［45］。水稻miRNA156过表达导致拟南芥、松树和水稻在冷胁迫下细胞活力和生长速率增加。OsmiR156通过靶向OsSPL3增加植物耐寒性，OsSPL3正向调节OsWRKY71的表达，而OsWRKY71是转录因子OsMYB2和OsMYB3R-2的 负 调 节 因 子。OsMYB2和OsMYB3R-2分别通过激活OsLEA3、OsRab16A、OsDREB2A和OsKNOLLE2、OsCTP1、OsCycB1.1、OsCycB2.1和OsCDC20.1表达来抵消低温胁迫所带来的负面影响［46］。

2.1.4 高温胁迫 高温作为一个重要的环境因素，会对植物生长、发育、繁殖等过程产生负面影响。植物响应高温胁迫是一个复杂的过程，涉及各种代谢和生化过程。苜蓿中的相关研究证明miR156参与植物热胁迫响应过程，mi156-OE转基因植物通过抑制靶基因SPL13从而增强其耐热性［47］。Arshad等［48］测量了热胁迫下野生型和miR156-OE转基因植物的各项生理参数，并收集了叶组织进行蛋白组分析，发现miR156-OE植物中的脯氨酸和抗氧化剂含量高于野生型，miR156-OE植物特有的蛋白质与多种功能有关，包括代谢、光合作用、应激反应和植物防御。

miR159/MYB在小麦和白菜的热应激过程中都起重要作用，小麦miR159过表达与靶基因GAMYB表达的下调相结合会导致其耐热性的降低，但单独过表达GAMYB却没有提高幼苗的耐热性，所以，miR159/GAMYB途径与热应激耐受性之间的因果关系还需要进一步研究［49-50］。此外，过表达miR160可以增加棉花对高温胁迫的敏感性，这与ARF10和ARF17表达受到抑制从而激活导致花药开裂的Auxin信号通路有关［51］。

2.1.5 养分胁迫 氮是植物中许多重要化合物的主要成分，参与植物一系列生化反应，并在作物的生物量积累和产量提升中发挥重要作用。钾则参与渗透调节、光合作用、物质运输等过程，可以提高植物的抗逆性。因此，缺乏这两种元素会导致植物生长受到限制。对花生的营养缺乏机制研究中发现，氮和钾缺乏会影响植物的生长，使植物表现出地上和地下部分组织干重降低，根长、根表面积、根体积、根活力降低和根呼吸减弱。氮缺乏显著降低初生根长度和侧根数量，这可能与miR160、miR167、miR393和miR396的上调以及AFB3和GRF的下调有关。主根和侧根对缺钾的反应与缺氮条件相反，表现为miR156、miR390、NAMATAF-CUC 4（NAC4）、ARF2和AFB3的 上 调，以 及miR160、miR164、miR393和SPL10的下调，这些可能有助于缺钾条件下初生根和侧根的生长［52］。

磷是植物不可或缺的一种常量营养元素，在发育和代谢过程中都很重要。虽然土壤中磷含量丰富，但大多数土壤中磷与钙、铁和铝等元素结合形成不溶性的化合物，限制了植物对磷的获取。缺磷是植物生长和发育过程中的常见胁迫。miR156/SPL3在拟南芥磷吸收过程中发挥着重要作用，过表达miR156的转基因植株与野生型相比磷吸收速度加快，并在缺磷状态下能减少根际酸化和花青素积累［53］。据报道，miR399是磷饥饿信号途径中的重要组分。最早在拟南芥中阐明miR399在磷饥饿信号传导中的功能，在磷饥饿条件下，miR399的表达被显著提高，而靶基因ubiquitin-conjugating E2 enzyme（PHO2）表达降低。为进一步研究miR399的功能，Hu等［54］对OsmiR399过表达植物进行了基因芯片分析发现，除了磷饥饿反应基因外，许多参与铁、钾、钠和钙吸收的基因也被显著上调，铁、钾、钠和钙的浓度也有所增加。此外，OsmiR399下游靶标LTN1（OsPHO2）的功能丧失也导致这些营养元素浓度增加以及相关基因的上调。miR399-PHO2途径参与植物对磷缺乏的适应性反应同样在玉米中存在［55］。

硫元素参与植物发育的许多重要机制和途径。土壤中的硫元素主要以硫酸盐（SO4-）形式存在并被吸收入根组织，通过脉管系统输送至地上部分，被还原成亚硫酸盐后在叶绿体和线粒体等亚细胞器官中硫化，用于半胱氨酸和蛋氨酸生物合成。而空气中的SO2是一种常见的污染物，在植物中，SO2主要通过叶组织气孔吸收，然后水合形成亚硫酸盐和亚硫酸氢盐。Yuan等［56］发现Osa-miR395的转录水平在硫酸盐缺乏条件下增加，这与前人在拟南芥中的研究结果相同。将Osa-miR395h在烟草中异源过表达损害了烟草硫酸盐稳态，NtaSULTR2作为miR395的靶点，属于低亲和力硫酸盐转运蛋白。Li等［57］发现拟南芥暴露在SO2中，miR398的表达下调，而靶基因铜或锌超氧化物歧化酶（Cu or Zn superoxide dismutases，CSD）的转录水平增加，同时SOD活性随着CSD转录水平的增加而增强，表明miR398在响应SO2诱导的氧化应激中起重要作用。然而，miR395的表达受SO2影响增加，下游靶基因APS3和APS4以及SULTR2；1的转录水平在拟南芥中降低，表明miR395在SO2暴露期间硫酸盐同化和易位的调节中发挥了重要作用。

2.1.6 重金属胁迫 重金属元素被认为是植物的生长和产量的主要限制因素，包括必需金属元素和非必需金属元素。多种生理过程需要必需金属元素，例如锌、锰和铜等，其他一些金属，如镉、铅或汞则是非必需金属元素。植物重金属中毒的显著特征是酶反应的中断和氧化应激。天然抗性相关巨噬细胞蛋白（natural resistance-associated macrophage proteins，NRAMP）是植物中不可或缺的膜转运蛋白，负责转运必需金属元素如锰或铁以及非必需金属如镉或铅。在甘蓝型油菜中发现了一个组成型基因BnNRAMP1b，它受镉胁迫而上调。结合降解组相关信息验证了BnNRAMP1b作为miR167的靶基因参与金属胁迫响应［58］。过表达miR156的转基因拟南芥减少地上部分重金属镉积累，增强了植物对镉胁迫的耐受性。在镉胁迫下，miR156OE具有初生根增长、生物量和叶绿素含量增高、抗氧化酶活性增强、ROS水平降低以及镉转运相关基因表达量降低的表现，而MIM156则相反［59］。

miR393在植物根组织铝中毒胁迫中具有一定的生物学功能。土壤中铝离子抑制大麦根尖miR393的表达，miR393的过表达可以消除铝离子对根伸长的抑制以及ROS积累所导致的细胞死亡。此外，miR393过表达减弱了外源生长素对铝诱导的根生长抑制的影响，并下调了铝胁迫下生长素响应基因的表达，这意味着miR393是通过改变大麦中的生长素信号输出来调节根对铝的敏感性［60］。

葡萄miR398通过调节靶基因VvCSD1和VvCSD2的表达，调控其对铜胁迫的响应过程。Vv-miR398的表达受到不同浓度铜胁迫抑制，而VvCSD1和VvCSD2基因的表达增强。与野生型相比，VvCSD过表达转基因植株具有更高的铜耐受性，并且在高浓度铜胁迫条件下降低ROS积累、提高SOD活性，这表明VvCSD增强ROS清除系统从而保护植物免受更多氧化损伤［61］。

2.2 生物胁迫

植物病原体包括害虫、真菌、细菌以及病毒，它们严重威胁植物的正常发育。植物免疫系统通过上调或下调miRNA的表达来诱导下游转录因子和基因表达以抵抗病原体的入侵。Caruana等［62］发现miR167通过ARF6和ARF8调节植物对病原体的防御反应。miR167响应细菌病原体假单胞杆菌而差异表达，其过表达赋予植物更高的抗菌性。这种抗性与生长素信号转导、水杨酸信号传导及气孔运动有关。此外，miR167-OE转基因植物的系统性获得抗性（systemic acquired resistance，SAR）反应也受到严重损害，进一步研究表明SAR的激活需要完整的生长素信号转导过程。总之，miR167在激素平衡以及植物生物防御过程中起着重要作用。

miR169在植物生物胁迫过程同样发挥着重要的作用。拟南芥miR169靶基因CLAVATA1（CLV1）和CLAVATA2（CLV2）的突变赋予植物更强的抗病性，而miR169的过表达能够消除clv突变体的抗病性表型［63］。水稻miR169过表达植株对病菌的侵染高度敏感，这与防御相关基因表达量的降低以及感染部位缺乏过氧化氢积累有关。此外，miR169通过抑制核转录因子Y（Nuclear factor Y，NF-YA）基因的表达而在对病菌的免疫过程中起负向调节因子的作用［64］。然而，香蕉miR169a和miR169b表达量在被病原体侵染后上调并在香蕉抗性品种中保持较高表达水平［65］。

NAC4作为miR164的靶基因之一，在拟南芥响应生物胁迫的细胞程序性死亡中发挥作用。研究表明NAC4过表达体和miR164沉默型植株对细菌病原体的过敏反应更加强烈，细胞死亡症状增强，而NAC4的 下 游 基因LURP1、WRKY40和WRKY54在细胞程序性死亡过程充当负向调节因子［66］。Wang等［67］发现，过表达miR164的靶基因OsNAC60增加细胞程序性死亡、加快离子泄漏、增强ROS积累、胼胝质沉积以及防御相关基因的上调，而增强水稻对稻瘟症的抵御能力。在上述研究中，miR164在植物生物胁迫过程中发挥消极作用，然而，在最新研究中也发现其具有积极调控作用。Hu等［68］在对棉花黄萎病的研究中发现，ghr-miR164作为正向调节因子可提高棉花对黄萎病的抗性，沉默其靶基因GhNAC100也可增强抗病性。还发现GhNAC100与GhPR3启动子的CGTA box结合抑制其表达，从而减弱植物抗病性。此外，miR164也在小麦的叶锈病以及杨树黑斑病防御过程中发挥重要作用［69-70］。

miR319在生物胁迫过程也起重要作用。番茄miR319-TCP4通过影响茉莉酸（jasmonic Acid，JA）合成基因表达和叶片内源JA水平，进而影响植物对根结线虫的抗性［71］。Zhang等［72］发现米曲霉菌株感染能特异性诱导水稻miR319的表达，抑制其靶基因OsTCP21表达。当miR319b-OE水稻受米曲霉菌感染时，LIPOXYGENASE2（LOX2）和LOX5作为JA合成过程中的关键酶被抑制表达［72］。Fan等［73］报告了miR319a/TCP参与毛白杨GA信号转导以及毛状体形成过程。miR319a过表达降低靶向的TCP转录水平，显著提高转基因杨树的叶毛密度，从而减轻昆虫危害性。

大蒜受病原体侵害诱导miR394表达而下调F-box和cytochrome P450（CYP450）基 因，因 此miR394及其对靶基因调控强度的差异可作为选择抗病大蒜品种的标志［74］。miR394作为拟南芥应对细菌感染的负调控因子，其过表达通过影响LCR以及许多参与植物miRNA代谢的关键基因AGO1表达从而提高植物对细菌的易感性［75］。Zhang等［76］在番茄中的研究也验证了miR394参与负向调控生物胁迫，miR394的过表达抑制其靶基因LCR的表达，进而抑制JA合成相关基因，从而降低番茄对致病疫霉的抗性。

在研究miR396在植物生物胁迫过程中作用时发现，miR396表达量降低赋予植物对真菌病原体的广泛抗性［77］。水稻过表达miR396靶基因Growth Regulating Factor（GRF）的转基因植物显示出更强的抗菌性，表明miR396通过抑制GRF而负向调控水稻对细菌侵染的抗性［78］。Chandran等［78］证明过表达miR396转基因株系对米曲霉高度敏感，而过表达其靶基因OsGRF6、OsGRF7、OsGRF8和OsGRF9的转基因植物对米曲霉的抗性增强。进一步研究显示，MIM miR396和GRF8-OE植物中类黄酮含量均增加，黄酮含量的增加与病原体抗性增强相关，这揭示了miR396-GRF8-F3H-类黄酮途径介导的新的病原体抗性机制［79］。

Zhang等［80］在对苹果抗菌性研究中发现，接种叶斑病真菌的叶片上，MdmiR395表达水平升高而其靶基因MdMRKY26、MdWRKYN1表达降低。过表达MdWRKY或抑制MdmiR395可以增加与抗病相关（pathogenesis-related，PR）基因的表达从而增强苹果的抗病性。Wu等［81］发现，当水稻遭受病毒危害时，miR528表达受抑制，这促进其靶基因L-抗坏血酸氧化酶（L-ascorbate oxidase，AO）表达从而减少AO介导的活性氧的积累。在之后的研究中又发现miR528-AO防御模块受SPL9的调控，SPL9与miR528启动子区域内特定基序结合从而激活miR528基因的表达［82］。

3 总结与展望

环境胁迫是影响植物正常生长发育的重要因素之一，不同的环境胁迫会诱导miRNA的差异性表达。miRNA作为调节植物胁迫响应的调控网络中心，其一举一动都会引起“蝴蝶效应”，因此对miRNA的研究有助于改良植物的遗传性状，提高其抗逆性。研究表明即使是同种miRNA在不同物种中对胁迫响应表现不同。例如，不同物种miR156在盐胁迫下的表达模式不同，苹果、玉米相似，拟南芥、甘蔗和水稻相似［24，40，83-85］。木本植物和草本植物在生命周期方面的差异可能解释了这种现象。一年生草本植物的生命周期比多年生木本植物短，所以当草本植物受到盐胁迫时，它们会将能量分配给防御机制，于是引起miR156积累抑制SPL表达，从而延长植物的幼年期，使其增强对不利环境条件的耐受性。与拟南芥和其他草本植物不同，多年生木本植物的幼年期较长，其与耐盐性之间的关系可能比草本植物更复杂。当苹果受到盐胁迫时，它通过下调miR156以上调下游靶基因SPL。某些SPL可增强侧根伸长和生物量积累，以抵消盐胁迫引起的能量消耗。其他SPL通过调控下游基因表达以调节植物生理和代谢过程以响应盐胁迫。除此之外，miR164、miR169在不同物种的生物胁迫方面也起着不同的调控作用［64-68］。即便依据miRNA片段小以及遗传冗余等特点，研究人员已经开发了Target mimicry（MIM）、Short tandem target mimic（STTM）技术等，但是大量的研究结果显示，miRNA具有组织和器官特异性。例如miR159在不同组织的表达量不同［86-88］。但目前尚没有确切的机制解释这些现象。未来对于单个miRNA的通路研究将可能说明这一现象，这将会成为未来研究趋势之一，其中单细胞测序技术可能在其中发挥重要作用。

随着二代测序技术以及miRNA研究技术的不断发展，越来越多新的miRNA被发现。然而目前的研究大多仅局限于miRNA及其靶基因在生物学过程中的作用，而miRNA是如何接收到上级信号以及通过级联反应影响下游各种调控途径的分子机制尚不清楚。因此，建立更为系统的miRNA调控网络将会成为未来另一个趋势。