一种酸枣仁提取物、茶氨酸、γ-氨基丁酸配方产品改善睡眠作用研究

陈希民,王 鑫,魏九龄,陈月晓,马姗婕,何 梅,李 东

(北京市营养源研究所,北京 100069)

睡眠障碍是由于睡眠的解剖部位发生病变或生理功能紊乱引起睡眠质量的异常或在睡眠时伴随某些临床症状,是睡眠和觉醒正常节律性交替紊乱的表现[1]。资料表明[2],儿童睡眠障碍发生率为10%～45%,青春期为11%～30%。2004～2013年间,中国0～12岁儿童睡眠障碍合并报告率为35.1%。我国老年人睡眠障碍发生率较高,约为20%～60%,且随着年龄增加,呈不断上升的趋势[3]。

酸枣仁中化学成分主要包括皂苷、三萜类化合物、黄酮类化合物、生物碱类化合物,是临床上中医药治疗失眠症状的首选药物[4],但实际应用中剂量浮动较大[5-10],效果也存在差异[11]。既往研究表明酸枣仁可延长果蝇睡眠总时间,同时片段化睡眠增强[12],并可显著增加小鼠总睡眠和REM时间[13]。茶氨酸是茶叶中含有的一种特殊的非蛋白质氨基酸,有着显著的抗焦虑作用,可显著提高大鼠脑组织中单胺类神经递质的浓度。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)作为一种抑制性神经递质起到分子信号的作用,对癫痫、惊厥、帕金森病等多种精神疾病具有一定的疗效。我国在2009年和2014年分别GABA和茶氨酸列入新食品原料[14-15]。酸枣仁、茶氨酸和GABA单独使用均具有一定的改善睡眠作用,三者联合使用效果未见报道。

因此,本文以小鼠为动物模型,旨在探索酸枣仁提取物、茶氨酸、GABA复合配方的调节睡眠作用,为酸枣仁、茶氨酸和GABA的有效利用及改善睡眠保健产品的研发提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

SPF级Balb-c健康雄性小鼠 180只,8周龄,18～20 g,南京市江宁区青龙山动物繁殖场;许可证号:SCXK(苏)2017-0001);酸枣仁提取物、茶叶茶氨酸、GABA 北京市营养源研究所提供;戊巴比妥钠(纯度>99%)、巴比妥钠(>99%) Sigma公司提供;蒸馏水 广东去城市食品饮料有限公司提供。

XS1003S型电子天平 瑞典Mettler Toledo公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物饲养与分组 SPF级Balb-c健康雄性小鼠180只饲养于东南大学动物实验室,室温(25±2) ℃,相对湿度55%±2%,12 h/12 h光照/黑暗,自由摄食和饮水。按体重分为3组,每组60只。各组件体质量无统计学差异。其中第1组进行延长戊巴比妥钠睡眠时间实验;第2组进行戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验;第3组进行巴比妥钠睡眠潜伏期实验;以上实验同时进行直接睡眠实验。因鼠类活动夜间比白天活跃,因此动物干预及实验开展均在夜间8点开展,消除动物活动状态变化对实验影响。

1.2.2 剂量设置 参考酸枣仁、茶氨酸、GABA文献资料中单独使用剂量[16-18],将复合配方人体每日摄入量设定569 mg/d(折算9.48 mg/kg·bw),其中为酸枣仁5.25 mg/kg·bw,(相当于原药材52.50 mg/kg·bw)、茶叶茶氨酸2.9 mg/kg·bw、GABA 1.33 mg/kg·bw。

复合配方以每日95、190、285 mg/kg·bw 3个剂量给予动物,分别相当于受试物人体摄入量的10、20、30倍。另设置蒸馏水作为对照组样品。受试物每日蒸馏水配制,每日灌胃。

1.2.3 动物干预 每组实验60只小鼠,适应性喂养3 d后,实验前,称量小鼠初始体重,并根据小鼠体重分为4组,分别是空白对照组(蒸馏水,20 mL/kg·bw)、低剂量组(95 mg/kg·bw)、中剂量组(190 mg/kg·bw)、高剂量组(285 mg/kg·bw),每组15只。各组动物每天灌胃1次,持续灌胃干预30 d。每周测量一次小鼠体重,调整灌胃剂量。

1.2.4 延长戊巴比妥钠睡眠时间实验 参考《保健食品检验与评价技术规范》[19],动物末次灌胃给予样品30 min后,各组小鼠腹腔注射50 mg/kg·bw戊巴比妥钠(i.p.)(小鼠100%入睡剂量,前期试验已验证),注射量为0.1 mL/10 g·bw。以小鼠翻正反射消失60 s以上作为入睡判定标准,以小鼠翻正反射消失到恢复这段时间为动物睡眠时间,比较受试物是否延长戊巴比妥钠注射小鼠的睡眠时间。

1.2.5 戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验 参考《保健食品检验与评价技术规范》[19],动物末次灌胃给予样品30 min后,各组小鼠腹腔注射30 mg/kg·bw戊巴比妥钠(i.p.)(小鼠10%～20%入睡剂量的阈下剂量),注射量为0.1 mL/10 g·bw。以小鼠翻正反射消失60 s以上作为入睡判定标准,记录30 min内各组入睡动物数并计算睡眠发生率。睡眠发生率(%)=(入睡动物数/每组动物数)×100。比较受试物是否增加阈下剂量戊巴比妥钠注射小鼠的睡眠发生率。

1.2.6 巴比妥钠睡眠潜伏期试验 参考《保健食品检验与评价技术规范》[19],动物末次灌胃给予样品20 min后,各组小鼠腹腔注射280 mg/kg·bw巴比妥钠(i.p.)(小鼠100%入睡剂量),注射量为0.1 mL/10 g·bw。以小鼠翻正反射消失60 s以上作为入睡判定标准,以小鼠注射巴比妥钠到翻正反射消失的时间作为睡眠潜伏期,比较受试物能否缩短巴比妥钠注射小鼠的睡眠潜伏期。

1.2.7 直接睡眠试验 各组动物每天给予受试物,观察灌胃后1 h内,小鼠是否出现睡眠现象,以动物的翻正反射消失超过60 s判为进入睡眠,比较空白对照组和配方产品各剂量组对小鼠的直接催眠的影响。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 改善睡眠配方对小鼠体重的影响

对延长戊巴比妥钠睡眠时间实验、戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验、巴比妥钠睡眠潜伏期实验中实验动物干预前后动物体重进行分析。由图1可知,实验前各组小鼠初始体重无明显差异(P>0.05);灌胃给予不同剂量的配方7、14、21、30 d后,各组小鼠体重均无显著性差异(P>0.05)。实验期间各组小鼠皮毛有光泽,饮食和活动正常。给予样品后,小鼠粪便湿润程度适中,未见腹泻和稀便等现象,表明配方产品在本试验设计剂量下对小鼠体重未造成明显影响。

图1 配方对小鼠体重的影响

2.2 配方对戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间的影响

按照《保健食品检验与评价技术规范》[19],在戊巴比妥钠催眠基础上,若复合配方干预后小鼠睡眠时间延长,说明复合配方与戊巴比妥钠有协同作用,结果见图2,空白对照组小鼠睡眠时间为(33.87±4.98)min,复合配方低、中、高剂量组(95、190、285 mg/kg·bw)干预后睡眠时间为(38.79±4.40)、(39.67±4.10)、(41.93±5.44)min。与空白对照组比较,低、中、高剂量组小鼠睡眠时间分别延长14.53%、17.12%、23.80%,均具有统计学差异(P<0.01)。说明一定剂量的复合配方与戊巴比妥钠具有协同作用,可以极显著延长小鼠睡眠时间。

图2 配方对戊巴比妥钠处理的小鼠睡眠时间影响

2.3 配方对戊巴比妥钠阈下剂量催眠的影响

对复合配方进行戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验,研究其对小鼠睡眠发生率的影响,由于戊巴比妥钠通过肝酶代谢,其诱导小鼠睡眠时间的长短反映了肝酶的活性[20],而对该酶有抑制作用的药物,也能延长戊巴比妥钠睡眠时间。为排除这种影响,将戊巴比妥钠剂量降至阈下剂量,即10%～20%小鼠入睡的剂量,进行阈下剂量催眠实验,结果见表1。

表1 小鼠戊巴比妥钠注射后睡眠发生率比较

由实验结果看出,空白对照组小鼠睡眠发生率为13.33%,符合本实验10%～20%的动物入睡要求,说明30 mg/kg·bw可用于戊巴比妥钠符合阈下剂量实验。低、中、高剂量组的睡眠发生率分别为33.33%、53.33%和73.33%,均高于空白对照组的睡眠发生率,且随着剂量增加,睡眠发生率逐渐增加。与空白对照组相比,低剂量组的睡眠发生率增加却不具有显著性差异(P>0.05),中、高剂量组睡眠发生率显著增加(P<0.05,P<0.01),且具有剂量效应关系。以上结果表明,复合配方与戊巴比妥钠的协同睡眠作用并非通过影响戊巴比妥钠的代谢过程而实现的。

2.4 配方对巴比妥钠睡眠潜伏期的影响

睡眠潜伏期即小鼠注射巴比妥钠至翻正反射消失之间的时间,睡眠潜伏期越短说明样品促进睡眠效果越好。结果见图3。巴比妥钠睡眠潜伏期实验中,复合配方低、中、高剂量组(95、190、285 mg/kg·bw)干预后,小鼠睡眠潜伏期分别为(44.87±4.08)、(38.87±8.46)、(38.93±6.01) min,与空白对照比较,低、中、高剂量组睡眠潜伏期时间分别缩短12.48%、24.19%、24.07%,差异有统计学意义(P<0.05)。随着剂量的增加,小鼠睡眠潜伏期也逐渐缩短,说明配方缩短小鼠睡眠潜伏期功效具有剂量-效应关系。实验结果表明,复合配方促进小鼠入睡作用良好,随着剂量增加,促进入睡效果呈增强趋势,具有缩短巴比妥钠睡眠潜伏期的作用。

图3 小鼠巴比妥钠干预后睡眠潜伏期时间结果

2.5 直接睡眠实验

通过30 d配方样品干预观察发现,低、中、高剂量组小鼠睡眠只数均为0只,说明配方无直接睡眠作用。

从戊巴比妥钠诱导睡眠时间实验、戊巴比妥钠催眠实验及巴比妥钠睡眠潜伏期实验结果可以看出,酸枣仁提取物、茶氨酸、GABA复合配方与戊巴比妥钠、巴比妥钠均具有较好的协同作用,即能够促进睡眠的发生,也有助于睡眠的维持。复合配方在95 mg/kg·bw剂量时延长戊巴比妥钠睡眠时间实验和巴比妥钠睡眠潜伏期实验结果阳性,此时,酸枣仁提取物、茶氨酸的剂量分别为52.29、29.05 mg/(kg·bw),当剂量提升至190及285 mg/(kg·bw)时,剂量亦远低于单独使用有效剂量[16-18],三种原料具有协同作用。出现协同作用的原因可能是a. 在成分上，酸枣仁和GABA均与谷氨酸代谢密切相关。刘静等[21]对酸枣仁蛋白质含量和氨基酸组成进行综合评价，结果表明酸枣仁蛋白质含量高达40%(干重)，其中18种常见氨基酸中，谷氨酸含量最高，占种氨基酸的30.95%；GABA是谷氨酸在谷氨酸脱羧酶的作用下形成的，属于谷氨酸的结构类似物；在结构上，茶氨酸属于酰胺类化合物，和GABA在结构也具有一定的相似性，从而导致其功能相近[22]。b. 在改善睡眠生理功能方面， 酸枣仁影响大脑皮质代谢性谷氨酸受体的表达,调节谷氨酸的释放[23],促进GABA合成,抑制下丘脑-垂体-肾上腺轴的过多活跃[24],同时可提高调节大鼠海马中5-T1AR和5-HT2AR的表达[25],改善睡眠状态;茶氨酸可促进大脑表面α波产生,使人体产生舒适愉悦的感觉;GABA在促进α波产生的同时抑制β波的产生,具有镇静大脑降低压力的作用[26],三者在生理上具有协同效应[15]。

3 结论

本实验研究通过延长戊巴比妥钠睡眠时间实验、戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验、巴比妥钠睡眠潜伏期实验和直接睡眠实验研究了酸枣仁提取物、茶氨酸。GABA复合配方的改善睡眠作用。根据《保健食品检验与评价技术规范》[19],延长戊巴比妥钠睡眠时间实验、戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验和巴比妥钠睡眠潜伏期实验中两个实验结果阳性,即可判定受试物具有改善睡眠的功效。本研究显示,复合配方具有改善睡眠功效且效果随剂量增加而升高。

本次研究的主要依据为《保健食品检验与评价技术规范》,根据其实验要求证实了酸枣仁提取物、茶氨酸、GABA复合配方具有改善睡眠的功效,指标检测主要集中于动物行为学的观察,三种原料复合使用在神经递质、细胞因子、激素、肽类等方面的共同作用有待于进一步深入研究。