食品中合成着色剂的提取方式及测定方法研究进展

廖若宇,孙 悦,刘新保,张春娥

(宁夏回族自治区粮油产品质量检测中心,宁夏银川 750001)

不同的物质具有不同的颜色,颜色对于万事万物来说至关重要,在食品中,颜色也是人们对食物最直观的评价指标之一。食品中着色剂按照其来源可划分为天然着色剂和合成着色剂。天然着色剂存在于植物、动物和微生物中[1],目前植物性着色剂的提取及研究较为广泛,在我国相关标准中约40种左右的天然着色剂被允许用于食品加工[2]。一些天然着色剂因具有高营养价值和保健功能而受到关注,但基质成分较为复杂——前期需要对植物油脂及果胶等大分子杂质进行脱除处理[3],因而增加了提取难度及提取步骤,同时由于其不稳定性——易受pH、光、热等[4]影响而发生褪色、变色,提取过程中环境因素和经济因素的制约,都限制了天然着色剂的应用发展。基于天然色素的诸多不稳定性,人们在制作食品时会人为添加一些食品添加剂——食用合成着色剂,来保持食物鲜艳的外观色泽。合成着色剂因合成的颜色更加鲜艳、不易褪色及价格低廉的特性而被广泛应用。按照化学结构来分,人工合成着色剂可分为偶氮类和非偶氮类着色剂。偶氮类着色剂是具有一个或多个—N=N—基团的芳香族化合物。在食品工业中,偶氮类着色剂约占普通着色剂市场的65%[5]。食品中常见的偶氮类合成着色剂有柠檬黄、日落黄、新红、胭脂红、诱惑红等。研究者测定了葡萄酒中柠檬黄、赤藓红、亮蓝等7种合成着色剂[6],酸奶中酸性红、亮蓝、日落黄等10种合成着色剂[7],火锅中新红、胭脂红、苋菜红、诱惑红、赤藓红等16种合成着色剂[8]等。食品中常见合成着色剂信息见表1。

表1 食品中常见着色剂的化学结构及属性

续表

1 食品中合成着色剂的提取方式

目前食品加工中应用最为广泛的当属合成着色剂,而合成着色剂又多为偶氮类。在对不同类别的着色剂测定前应先选取合适的预处理方式,从而使食品基质中的着色剂充分提取并去除其他干扰物质,保证测定结果的准确性。在食品类别中,因天然着色剂和合成着色剂存在溶解性差异,无论是水溶性还是脂溶性着色剂,均可使用有机试剂进行提取,如甲醇、石油醚、丙酮等,但水溶性着色剂在提取时还会辅助使用水、氨水、草酸、盐酸等,以便着色剂被充分提取[12-14]。GB 5009.35-2016《食品安全国家标准 食品中合成着色剂的测定》[15]中规定前处理方法为聚酰胺吸附法及液-液分配法,但这两种方法操作繁琐、使用不便且费时。目前有关合成着色剂的提取方式有很多研究,如表2。

表2 食品中合成着色剂不同提取方式的比较

1.1 膜过滤

膜过滤是一种精密的分离技术,可以实现分子级过滤。在压力差存在的前提下,利用膜孔隙的选择透过性进行两相分离,使溶剂、无机离子等小分子透过膜,而截留住大分子的一种提取方式[16]。史晓博[17]对番茄皮色素和葡萄皮色素提取浓缩,研究结果表明:在压力为0.60 MPa,料液温度为40 ℃,流速为53.50 m/s时,500 Da的RC膜,适用于番茄皮色素提取液浓缩,并且此条件下浓缩最佳倍数为30;而0.80 MPa的压力,料液温度50 ℃,流速71.34 m/s条件下300 Da的PTFE膜,适合于葡萄皮色素的提取,该条件下浓缩最佳倍数为25。Gosetti等[18]将待测市面上购买的开胃酒样品过0.2 μm聚丙烯膜后,利用高效液相色谱-二极管阵列-串联质谱对其进行测定,最终得出的样品经太阳光照射后存在一定程度的脱色效应,这可能涉及到葡萄糖-果糖的参与,并且在脱色样品中检测出的降解产物可能具有毒性,由此推断出市面上购买的开胃酒存在一些含有萘基结构的杂质。

1.2 固相萃取(SPE)

固相萃取于20世纪70年代中期引入,是基于液-液萃取和液-固萃取而延伸出的一种新型萃取技术。它是利用选择性吸附与选择性洗脱的色谱分离原理,使液体样品通过吸附剂吸附而保留分析物,再用合适的溶剂清洗去除杂质,最后用洗脱剂洗脱分析物的方法,通常包括活化、上样、淋洗和收集四个步骤。该方法因保证回收率的同时缩短了提取时间,避免发生乳化现象,减少有机试剂的用量,对样品的净化、富集有着重要作用,适合实验室大批量前处理工作而被广泛应用于各项研究[19-21]。通常情况下选用甲醇、甲酸、乙腈等有机溶剂作为萃取溶剂提取食品中的各种着色剂。马桂娟等[22]研究通过利用PWAX-SPE固相萃取小柱,在V无水乙醇∶V氨水∶V水(7∶2∶1)的组合条件下,7种合成着色剂的回收率较高。李素媛等[23]研究通过利用PWAX混合型弱阴离子交换柱测定碳酸饮料、果酒、肉制品、巧克力等食品中柠檬黄、新红、苋菜红等9种合成着色剂,依次用甲醇、水活化小柱后,再用6 mL水(pH=4)、6 mL甲醇-甲酸、6 mL水(pH=6)淋洗,经液相测定各着色剂标准液浓度与峰面积相关系数均在0.999以上,具有良好的线性关系。赵俊等[24]选用聚酰胺SPE净化小柱,经甲醇和水依次活化后,选取氨化甲醇洗脱,收集样品过0.45 μm滤膜后待测,最终得到柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红及亮蓝6种合成着色剂加标回收范围在86.2%～97.5%之间。

1.3 液-液萃取(LLE)

液-液萃取法又称溶剂萃取法或抽提,是在液体混合物中加入与其不相混溶(或稍相混溶)的特定溶剂而达到分离或提取目的的分离方法[25]。提取食品中着色剂的常用试剂有水、乙醇、甲醇、异丙醇、氨乙醇、氨水、环己烷和四正丁基铵磷酸盐等[10]。郭京波等[26]研究通过利用[C8MIM][BF4]作为萃取剂,离子液体为350 μL,pH=6.0的醋酸-醋酸钠作为缓冲液,保温10 min,离心5 min后,对柠檬黄和亮蓝具有较好的加标回收。Lidia等[27]首次利用乙醇和水加压液液萃取法进行前处理,搭配高效液相色谱-串联质谱、二极管阵列检测器、APCI离子源,从衣藻中提取类胡萝卜素和叶绿素并进行测定,得到在不同提取条件下衣藻提取物均具有抗氧化活性,并且推断了从逻辑关系上看,不同活性取决于相关色素的性质。汪芳芳等[28]利用5%的氨水甲醇混合溶液作为萃取剂,再用冰乙酸将滤液调至中性,旋蒸浓缩后用甲醇/水(1∶1,V/V)溶解残渣并定容,上高效液相色谱测定掺假玉米馒头中的柠檬黄含量,测得回收率在93%～110%,相对标准偏差小于9.1%。

1.4 其他提取方式

尽管固相萃取和液-液萃取在实际操作中已达到提取目的,但有时还会用到微波辅助提取(MAE)、超声辅助提取(UAE)及热辅助提取(HAE)等作为绿色辅助提取方式,来缩短合成着色剂的提取进程,以达到快速、高效的目的。周良芹等[29]通过超纯水和甲醇溶液溶解样品,超声提取20 min后离心,分离出上层清液过膜后待测。Hanwen等[30]研究通过利用甲醇和乙酸的混合溶液(V甲醇∶V乙酸=95∶5)作为提取剂,微波辅助提取肉中21种合成色素的方法。Pinela等[31]研究了一种在密闭容器水浴加热辅助提取芙蓉花粉中天然食用花青素的方法,取0.6 g样品与20 mL乙醇与水混合溶剂,在一定温度和时间内进行提取,提取后将混合物在设定的转速下离心,最终上清液过滤纸备用。

无论天然着色剂还是合成着色剂在前处理过程中都会用到有机试剂,具体依据着色剂溶解度性质而定,但天然着色剂往往还需要先使用乙醇或酸碱溶液破坏植物结构,并且在提取过程中需要严格控制其pH、温度等条件,因此多用膜过滤辅助超声波方式对植物色素进行提取。相反,合成着色剂稳定性好,多数易溶于有机试剂,故提取方式多为固相萃取及液-液萃取等方式。

2 食品中着色剂的常用测定方法

基于食品样品的多样性与复杂性,现用于测定食品中合成着色剂的方法也呈多样性(表3)。

表3 食品中合成着色剂不同测定方法的比较

2.1 色谱法

2.1.1 薄层色谱法(TLC) 薄层色谱是色谱法的一种基本类型,利用两种物质间的吸附力差异,使被测物质与固定相之间发生吸附与解吸附作用,从而达到样品分离效果并形成系列斑点,最终参与定性和定量分析的分析方法[35]。其特点是操作成本低廉,操作方便,样品用量少,但对操作者技术要求较高,并且检测准确度低[36]。Florin等[37]研究了一种可结合扫描色谱图像处理的高效薄层色谱法,将带有3-氨基丙基官能团的多孔硅胶固定在基质上,按比例将流动相异丙醇、乙醚和氨混匀,最终通过软件进行定量评估。张倩茹等[12]通过自制薄层色谱,尝试以石油醚、乙酸乙酯、正己烷及丙酮为展开剂,发现在110 ℃、30 min时,8∶2的石油醚-丙酮作为展开剂,或者6∶4的石油醚-乙酸乙酯、正己烷-丙酮和正己烷-乙酸乙酯作为展开剂时,分离菠菜中的天然色素效果较好。Muhammad等[38]研究发现在植物色谱分析方面,像PVC/PVA这类共混聚合物薄膜制作的薄层色谱板非常有效,当PVA含量高达8%时,以乙醚和丙酮混合物作为展开剂分离植物色素效果更好。

2.1.2 高效液相色谱法(HPLC) 高效液相色谱法是目前为止应用最为普遍的一种方法,因为其灵敏度高、线性范围广、重现性好且实验过程中引入的不确定度小而被广泛使用[39-41]。在食品样品着色剂检测中多与二极管阵列检测器、紫外检测器配合来进行测定[42]。高效液相色谱法是一种利用压力(高压泵)将样品送入填充过固定相的色谱柱中,使待测组分经过一系列分配、吸附或离子交换等过程而实现分离,最终经检测器对分离的物质采样进行分析的分离技术[43-45]。李丹梅[46]利用Ecllpse Plus C18色谱柱分离,二极管阵列检测器,柱温30 ℃,254 nm波长,5.5 min变更波长为628 nm,柱流量1.00 mL/min,甲醇及0.02 mol/L乙酸铵溶液的流动相条件下,进样10 uL,能在7 min分离完成且得到分离度较好的5种着色剂。吕志勇等[47]采用C18色谱柱分离,紫外检测波长254 nm,柱温30 ℃,流速0.8 mL/min,进样2 uL,以乙酸铵溶液(0.02 mol/L)和甲醇作为流动相进行梯度洗脱,19 min使发酵乳中的8种着色剂得到分离。Harp等[48]研究了通过使用液相色谱法配合光电二极管阵列检测器测定44种食品中的七种合法着色剂,该方法测定了不同种食品中着色剂的线性、精密度、各种基质的回收率、检测限、定量限和每种着色剂的相对标准偏差等,发现食品着色剂总添加含量从1.9到1221 mg/kg不等,并以此作为儿童饮食评估。

2.1.3 反向高效液相色谱法(RP-HPLC) 反向高效液相色谱是由极性流动相和弱极性固定相所组成的液相色谱体系,它正好与正相色谱(由极性固定相和弱极性流动相所组成的液相色谱体系)相反,多用于测定非极性、极性或离子型化合物[49]。Mathiyalagan等[50]研究了利用反向高效液相色谱仪配合紫外可见检测器测定食品基质中的半合成叶绿素(Cu-Chl)和合成食品着色剂,在400 nm处测量,提取得到不同食品基质中Cu-Chl和合成着色剂的回收率为90%～97%,RSD为1%～9%。邹建宏等[51]研究建立了一种反向高效液相色谱仪配合紫外检测器同时测定进口果汁中8种添加剂含量的方法,在230 nm波长处,用HypersiI BDS C18色谱柱,甲醇和乙酸铵混合溶液作为流动相,梯度洗脱,流速为1.0 mL/min,柱温40 ℃下测定,在10 min内8种组分均得到良好的分离,此方法平均回收率可达到90%～114%,RSD为1.3%～8.0%。Minioti等[52]研究了利用反向高效液相色谱仪配合二极管阵列检测器测定水溶性食品中的13种合成食品着色剂,在350～800 nm之间利用梯度洗脱,在29 min内成功分离所有化合物,该方法适用于各种只需简单预处理(稀释或加水)的水溶性色素食品的测定。

2.1.4 液相色谱-质谱法 液相色谱-质谱法定性能力较强,在多离子反应监测模式(MRM)下,通过两级离子的选择而排除大量干扰离子,降低了质谱的化学背景,使相应的目标检测物信噪比提高,从而实现高灵敏度及准确性的检测[53]。液质联用法前处理较为简单,不用离子对试剂做流动相,无需衍生化,但单检测少数几种合成着色剂时,检测成本较高[54]。Arrizabalaga-Larraaga等[55]利用超高效液相色谱-串联质谱法,对比电喷雾电离(ESI)、大气压化学电离(APCI)和大气压光电离(APPI)三种离子源对橄榄油中类胡萝卜素和叶绿素及其相关化合物进行测定和比较,最终发现在APCI和APPI下,以多反应监测(MRM)模式进行测定,得到结果具有低检测限(0.004～0.9 mg/L)、低基质效应(<25%)和高提取效率(62%～95%)。曾凯等[56]利用超高效液相色谱-串联质谱法,在多反应离子监测(MRM)模式下,对红酒、葵花籽油等不同基质样品中碱性橙、罗丹明、苏丹红等六种非食用性色素进行测定,得到方法检出限为1.0～20.0 μg/kg,回收率在72.4%～114.7%,相对标准偏差(RSD)为3.4%～11.3%。

2.2 分光光度法

分光光度法是在特定波长处或一定波长范围内,依据溶液物质的离子及分子对入射光吸收度的不同,对被测物进行定性及定量测定的方法。由于仪器成本低廉,操作简单而成为常见分析技术之一,多用于食品添加剂检测[57-58]。郭群等[59]研究发现日落黄和柠檬黄的最大吸收波长分别为482和426 nm,建立浓度与吸光度的线性拟合预测模型,得到相关系数分别为0.9948和0.9973,说明该模型能较好的预测出两者之间的关系。吴文君等[60]利用双波长比值法测得诱惑红、日落黄和柠檬黄分别在0.8～30、0.7～33和0.6～30 mg/L的质量浓度范围内线性关系较好。Adil[61]应用超声辅助浊点萃取技术,以聚氧乙烯单月桂酸酯为萃取剂,优化溶液pH、金属量、温度、超声效果、溶剂类型及溶剂浓度等变量后,用分光光度法对食品中胭脂红进行测定,得到两种不同水平下加标回收率为94.8%～104.7%,证明了分光光度法测定合成着色剂准确性和精确性均较好。

2.3 毛细管电泳(CE)

在通过分离技术来检测食品中合成着色剂的方法中,毛细管电泳(CE)是一种20世纪80年代兴起的液相微分离技术。在毛细管通道里,因样品中各组分电泳迁移率及分配系数存在差异,当直流高压电场作用时,被测组分得以分离。该方法分离效率高,消耗试剂少,分离速度快,分析样品范围广泛,也被应用于食品中着色剂的检测,但其灵敏度和选择性低以及基质干扰作用限制了该方法在分析中的进一步使用[62-63]。Richard等[64]研究了一种毛细管电泳法,通过采用胶束电动色谱模式,15 min内实现了软饮料中人造甜味剂、防腐剂及色素的分离,利用二极管阵列检测器监测标准品谱图,从而实现样品组分匹配。Prado等[65]开发了一种在酒精饮料中使用毛细管电泳分析合成着色剂的方法,在35 ℃下使用73 cm的熔融石英毛细管,10 mmol/L磷酸盐缓冲液和10 mmol/L十二烷基硫酸钠,pH11,25 kV电压下进行测定。在两个浓度水平下,合成着色剂平均回收率分别为92.6%和104.0%,重复性较好,证明了方法准确性。

2.4 酶联免疫吸附测定(ELISA)

酶联免疫吸附测定是一种应用抗原抗体特异性结合原理而分析和测定的技术,它要求被测物必须能够作为抗原或者抗体存在。该方法通常被用于食品行业中各种添加剂的检测,以监测过敏性成分对食品的污染。其主要特点是应用范围广、特异性强、高灵敏度、低检测限和低成本[66-67]。Xing等[68]开发了一种基于多克隆抗体的间接酶联竞争免疫吸附方法,通过合成的日落黄半抗原与载体蛋白偶联,以合成免疫原和包被抗原,将具有特异性的抗原抗体结合,最终测得食品和血清样品的回收率为94%～106%,证实了该方法的可操作性。

2.5 电化学传感器

食品添加剂、生物分子的电化学行为以及电化学测量系统的发展促使在食品、农业及环境监测中均可以利用化学传感器来分析特定的化合物。电化学传感器因其高灵敏度、高选择性、响应时间短、快速简单、易于小型化而在蛋白质组学、生物化学等多方面应用[69-72]。Meiling等[73]采用一种多孔石墨烯材料——石墨烯纳米网作为电极修饰材料,通过改进使苋菜红分子吸附到了工作电极的表面,有利于电子的快速扩散。电化学信号的增强表现出了更宽的线性响应。Wensheng等[74]通过在N-甲基-2-吡咯烷酮中超声剥落石墨粉制备出一种石墨烯纳米片(GS),分别研究了pH、GS修饰量、累积电势和时间对苋菜红氧化峰电流的影响。线性范围2.5～15 nmol/L,检测限0.75 nmol/L,表明方法具有可靠性。

2.6 表面增强拉曼散射(SERS)

拉曼光谱是一种散射光谱,可以反映分子的特征结构。表面增强拉曼散射(SERS)是一种将待测物质分子置于粗糙金属表面,通过等离子体共振的方式,从而增强拉曼光谱信号强度的现象。因其操作过程简单快捷,不需要大型的仪器参与,被广泛应用于材料分析,环境监测,医药管理,农药残留及食品等领域[75-78]。王乐等[79]采用25 mV/s扫速制备的多孔银丝作为表面增强拉曼基底,对新红进行定性及定量分析,结果表明:测试时间2 min,回收率为87.8%～93.8%,RSD小于6.5%,该方法可应用于食品中新红的快速检测。Xie等[80]利用SERS对黄鱼、红辣椒、红酒等食品样品进行检测筛选,试验结果与高效液相色谱法进行比对,验证了核壳纳米粒子能够检测食品中的色素,并且其在快速检测方面表现出了良好的性能。Ai等[81]通过分析了4种不同食用着色剂的SERS光谱,鉴定特征谱带,获得了具有高SERS活性底物的花状银纳米结构,并利用主成分分析改进其检测方法。

2.7 示波极谱法

食品工业中合成着色剂的示波极谱法测定,是一种高灵敏度的单扫描极谱法。同薄层色谱法相比较,该检测法操作简单,速度快且成本低廉[82-84]。宋新等[85]利用示波极谱法对苋菜红、胭脂红、柠檬黄等5种合成着色剂的最低检出限、检出浓度、标准曲线线性范围及加标回收率等多项指标进行测定,同时将检测结果与高效液相色谱法测定结果进行比对,发现示波极谱法和HPLC测定结果的差异无统计学意义。刘红等[86]采用单扫描示波极谱法对饮料中的3种混合着色剂(柠檬黄、苋菜红和胭脂红)进行测定,选取NaH2PO4-Na2HPO4作为底液,pH=8.10时,得到峰电流Ip与三种着色剂浓度在一定范围内呈线性关系,该方法测得回收率为98.5%～107.7%。

虽然合成着色剂的测定方法有很多种,但是高效液相色谱法因其灵敏度高、分离度好而被广泛应用。既可以检测天然着色剂,也可以检测合成着色剂。天然着色剂由于其见光易分解特性,不适宜采用分光光度法测定,推荐使用成本较低的薄层色谱法进行测定。

3 总结

任何食品样品在分析测试前,都需要经过前处理排除干扰物。目前,食品合成着色剂的前处理方式主要有固相萃取法、液-液萃取法、浊点萃取、超声辅助溶剂提取和其他一些提取方法。食品合成着色剂的检测方法主要包括毛细管电泳法、分光光度法、色谱法、MIPs和ELISA试剂盒法,最近,基于电化学法改进的传感器由于其操作简单、速度快、灵敏度高、选择性好、成本低及重现性好的特性,在食品安全分析领域引起了广泛关注。食品样品基质较为复杂,合成着色剂又多为水溶性色素,快速、简单、高效及环境友好的提取方法将越来越受到推崇。目前QuEChERS法多用于农药及兽药残留的前处理,而浊点萃取技术在食品、药业、日用品、土壤、水质和环境监测领域应用广泛,如果能将这些新兴技术应用于着色剂的提取,不仅减少了对人体有害的有机溶剂的使用,也避免了挥发性有机溶剂对环境的影响,同时降低前处理成本。本文综述食品合成着色剂现有的提取方式和测定方法,建议在开发食品合成着色剂新型检测方法时,应考虑新方法的应用前景和推广成本。