利用CRISPR/Cas 9编辑红曲霉pyrG基因对其次生代谢的影响

唐光甫 桂艳玲 满海乔 赵杰宏

（贵州中医药大学 贵州省中药生药学重点实验室，贵阳 550025）

红曲霉（Monascus）作为我国传统药食两用真菌，已有上千年历史［1］，目前常利用红曲霉发酵生产多种食品，如娃哈哈红曲藜麦饼干、茅台不老红曲酒、红曲腐乳和红曲腌渍鱼等，红曲色素也被广泛用作食品添加剂。现代科学证明红曲霉能生产麦角固醇、洛伐他汀、γ-氨基丁酸等多种功能活性物质［2］，已有脂必妥、血脂康等药品和纳豆红曲、灵芝红曲等保健品的上市销售。但自从红曲产品中检测出桔霉素这种真菌毒素［3］以来，红曲产品的生产和应用受到很大影响［4］。因此深入研究红曲霉次生代谢产物的遗传调控、加快选育安全、高效的红曲霉菌种非常重要。

已报道通过同源重组技术先后开展了CntA/Orf2［5］、CtnB/Orf4［6］、CtnE［7］、CtnF［8］、CtnG［9］、CtnH［10］、Orf1［11］、Orf3［12］、Orf6［13］、Orf7［14］和pksCT［15］等基因的敲除实验，初步证实了多个桔霉素合成相关基因。有研究报道尿嘧啶核苷的天然产物能够成为新型小分子的抑制剂［16］，而黑曲霉pyrG基因（乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶基因）的破坏能增强糖酵解通量，并显著提高柠檬酸盐及其前体的量［17］，可见尿嘧啶核苷及其合成关键基因pyrG在真菌物质代谢上有重要功能。本文通过构建红曲霉Cas 9底盘菌株，利用体外转录合成的sgRNA转化其原生质体实现对pyrG基因的定向编辑，为红曲霉构建了快速基因编辑体系，并证实pyrG基因对红曲霉的次生代谢有重要影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 紫色红曲霉（Monascus purpureus）菌株由贵州中医药大学生药学实验室提供，农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA 105和 大 肠 杆 菌（Escherichia coli）TOP 10感受态（购自北京华越洋）。

1.1.2 试剂 pGM-T克隆试剂盒和Genegreen核酸染料（购自北京天根生化），sgRNA体外转录试剂盒（购自重庆英茂盛业），T7EI核酸内切酶（购自北京唯尚立德），尿嘧啶核苷和5-氟乳清酸（5-FOA）（购自上海生工），纤维素酶、溶壁酶和蜗牛酶（购自北京索莱宝），pDHt/sk-PC（购自Addgene），桔霉素Elisa检测试剂盒（购自上海纪宁）。

1.2 方法

1.2.1 CRISPR/Cas9遗传转化 将pDHt/sk-PC（含Ppdc-toCas9-Tpdc表达框）质粒经冻融法转化农杆菌EHA 105感受态，涂布在含50 mg/L Kan的LB培养基上筛选，使用Cas 9检测引物（表1）对抗性菌落分别PCR鉴定，将获得的农杆菌阳性菌株在含50 mg/L kan液体LB培养基中培养，取菌液离心去除上清，用IM培养基稀释至OD600值为0.15-0.2，再在相同条件下培养4-6 h，至其OD600值为0.6-0.8。用此菌液稀释红曲霉孢子至106个/mL，取200 μL涂布于铺有0.45 μm硝酸纤维素膜的Co-IM培养基［18］平板上，25℃暗处共培养3 d，将长出的菌落和硝酸纤维素膜一起揭下倒扣在含20 mg/L潮霉素和300 mg/L头孢霉素的沙氏培养基上筛选，2 d后揭下硝酸纤维素膜，挑取抗性红曲霉单菌落使用Cas 9检测引物分别进行PCR分析。

表1 PCR检测引物和sgRNA序列Table 1 Primers and sgRNA sequences for PCR detection

1.2.2 原生质体制备 将红曲霉底盘菌株接种在含潮霉素的PDA平板上培养15 d后，用无菌水冲洗孢子，制成1×108个/mL的孢子悬液涂布于铺玻璃纸的PDA平板上，40 h后刮取菌丝，按比例（M∶V=1∶30）加入酶裂解液［19］（用1.0 mol/L MgSO4配制，含1.0 g/L纤维素酶、3.0 g/L的溶壁酶和10.0 g/L的蜗牛酶），置于60 r/min和30℃摇床中酶解2.5-3 h，然后在显微镜下统计原生质体的数量。

1.2.3 sgRNA合成和转化 将橙色红曲pyrG基因（GenBank：GU723506.1）序列在NCBI 与紫色红曲基因组blast，将共有序列提交到http://crispor.tefor.net/在线设计pyrG的sgRNA（图1）及其检测引物对（表1）送北京六合华大基因公司合成。利用体外转录试剂盒合成sgRNA，并经电泳检测。取100 μL原生质体加入10 μL sgRNA，冰浴30 min后加入1 mL PTC溶 液（PEG 4000 40%、pH 8.0 Tris 50 mmol/L、CaCl250 mmol/L），室温放置40-60 min，取300 μL涂布在含20 mg/L潮霉素、20 g/L尿嘧啶核苷和1.5 g/L 5-FOA的CM再生培养基（蔗糖210.38 g/L、酵母膏6 g/L、酪氨酸6 g/L、琼脂20 g/L）上30℃恒温培养4-7 d。利用Cas 9引物对长出的抗性红曲霉菌株进行PCR扩增、T7EI酶切和测序鉴定。

图1 pyrG基因sgRNA靶标序列Fig. 1 Target sequence of sgRNA for gene pyrG

1.2.4 化学成分测定 将液体沙氏培养基二级接种培养14 d后的菌丝体过滤，45℃干燥后研碎。测定红曲色素，精密称取0.10 g菌丝粉末加入10 mL 70%乙醇摇匀，60℃水浴1 h，然后补足10 mL滤过，将滤液倒入25 mL容量瓶中定容，用紫外分光光度计检测505 nm吸光度，计算红曲色素的色价（色价U/g=吸光度×稀释倍数×浸提溶剂体积/样品质量）。测定洛伐他汀，取1 mL发酵液加入9 mL 70%乙醇混匀，放入恒温振荡器28℃、130 r/min振荡1 h，然后4 200 r/min离心5 min，取上清液检测237 nm处吸光度值来判断含量高低［20］。测定桔霉素，称取菌丝体粉末0.30 g，加入2 mL 70%甲醇超声10 min后，取1 mL悬浊液12 000 r/min离心10 min，取上清液用桔霉素 ELISA试剂盒进行测定，同步制作桔霉素标准曲线（图2）。

图2 桔霉素标准曲线Fig. 2 Standard curve of citrinin

1.2.5 数据统计及显著性分析 实验数据以Graghpad prism软件分析，以“平均值±标准偏差”（Mean±SD）表示。分析方法为“单因素方差分析-多重比较-Turkey检验”，*P<0.05表示有显著性差异，**P<0.01有较显著差异，***P<0.005有极显著差异。

2 结果

2.1 制备红曲霉Cas 9底盘菌株

将含Ppdc-toCas9-Tpdc表达框的pDHt/sk-PC质粒经冻融法转化农杆菌EHA 105感受态，对Kan平板上的抗性农杆菌菌落PCR检测（图3-A），获得阳性转化菌株，然后与紫色红曲霉孢子悬液共培养（图3-B），再转接到添加Hyg和Cef的平板上进行抗性筛选，使用Cas 9引物对抗性红曲霉菌落进行PCR检测（图3-C），获得了转化成功的红曲霉Cas 9底盘菌株。

图3 农杆菌介导Cas 9转化红曲霉Fig. 3 Transformation of Cas 9 into monascus mediated by A. tumefaciens

2.2 体外sgRNA转化原生质体

基因pyrG是否变异可以通过在添加5-FOA和尿嘧啶核苷的培养基上筛选，能够正常生长的菌株，推测其pyrG基因发生突变并丧失功能，因此需建立5-FOA对紫色红曲霉的最佳筛选浓度。通过比较不同浓度5-FOA对红曲霉生长的抑制作用，发现当5-FOA浓度达到1.5 g/L时，红曲霉完全被抑制（图4-A），故选择1.5 g/L的5-FOA作为红曲霉筛选浓度［21］。使用体外转录试剂盒合成pyrG基因的sgRNA，电泳检测表明条带大小正确（图4-B），经PEG介导将sgRNA转化到红曲霉原生质体中（图4-C），在含20 mg/L潮霉素、20 g/L尿嘧啶核苷和1.5 g/L 5-FOA的培养基上筛选，获得了抗性红曲霉菌株（图4-D）。

图4 体外sgRNA转化红曲霉原生质体Fig. 4 Transformation of monascus protoplasts by sgRNA in vitro

2.3 突变株pyrG基因变异分析

用pyrG引物对获得的抗性红曲霉菌株PCR扩增，部分PCR产物的序列有明显的局部套峰（图5-A），说明序列上存在变异导致错峰。虽然5、6、7、8号菌株PCR产物是单条带（图5-B），但用T7EI核酸内切酶检测pyrG序列与野生型的杂合性时，结果显示5号和6号在突变株泳道及混合泳道上均切出了第2条带，可见5号和6号菌株有变异位点，属于杂合基因型；7号菌株仅在混合泳道切出了第2条带，属于纯合基因型（图5-C）。经测序证实，pyrG基因序列被CRISRP/Cas9成功编辑。4个突变菌株中，5号和8号在相同位点均缺失2个碱基，6号和7号在临近位点各缺失1个碱基，变异均发生在PAM位点上游2-5 bp范围（图5-D）。

图5 红曲霉突变株pyrG基因的变异分析Fig. 5 Variation analysis of pyrG gene of monascus mutant

2.4 突变株的形态特征

通过CRISPR/Cas 9技术把pyrG基因编辑成功的红曲霉菌株接种在含潮霉素、5-FOA和尿嘧啶核苷的培养基上能够生长，而野生型不能生长，可见突变株的pyrG基因失去了功能，不受5-FOA的影响，产生对尿嘧啶核苷的营养依赖性。对突变株的菌落形态、显微结构（400×）和生长速率进行观察，除了pyrG突变株菌体的正面颜色略有变淡外，菌落、分生孢子和闭囊壳的形态特征没有较明显的变化（图6），说明pyrG基因变异未导致菌株出现很明显的生长发育差异甚至畸形，推测pyrG基因可能对红曲霉的次生代谢有影响。

图6 部分突变株的菌落形态和显微特征Fig. 6 Colony morphology and microscopic characteristics of partial mutant strains

2.5 突变株化学成分的含量变化

比较突变株与野生型主要化学成分的含量，结果显示（图7），培养基中添加尿嘧啶核苷的野生型比不添加的对照菌株中洛伐他汀和红曲色素含量极显著增加，桔霉素含量极显著减少。可见，尿嘧啶核苷对红曲霉的次生代谢有重要影响。当在添加尿嘧啶核苷的培养条件下比较突变株与野生型菌株，结果显示，洛伐他汀含量在9个变异株中均有增加（图7-A）；红曲色素含量在4个变异株中有增加，在5个菌株中不同程度减少，增减比较随机（图7-B）；桔霉素在7个变异株中显著增加，另2个变异株的桔霉素含量未增反降（图7-C）。因为洛伐他汀、红曲色素和桔霉素皆属于聚酮类化合物，其主干代谢途径较一致，代谢流之间相互关联，因此pyrG基因变异造成的影响比较复杂。

图7 培养基中添加尿嘧啶核苷对不同菌株化学成分含量的影响Fig. 7 Effect of uracil riboside on the chemical composition content of different strains in medium

3 讨论

CRISPR/Cas 9是一种基因靶向修饰技术，通过sgRNA与靶向基因序列结合，引导Cas 9核酸内切酶对靶序列进行切割，然后细胞在DNA修复过程中产生的InDel导致目的基因移码和功能缺失［22］。该技术作为一种简单、快速的基因编辑工具［23］，主要通过Cas 9核酸酶和靶向sgRNA共同发挥作用，一般需要针对不同靶向序列设计和构建Cas 9和不同sgRNA的共表达载体，再对真菌遗传转化才能实现基因的定向编辑，导致基因功能研究耗时费力。如果有表达Cas 9的底盘菌株，研究基因功能时仅需导入不同的sgRNA即可实现各种基因的编辑目的，从而简化实验。

本研究通过农杆菌介导遗传转化获得了Cas 9组成型表达的红曲霉底盘菌株，再把人工合成的pyrG基因靶向sgRNA通过PEG介导法转化Cas 9底盘菌株原生质体，构建了体外sgRNA对红曲霉Cas 9底盘菌株中pyrG基因的定向编辑。pyrG基因是尿嘧啶核苷合成中的关键酶，能把5-FOA转化为有很强细胞毒性的 5-氟尿嘧啶核苷酸，从而抑制野生型菌株的生长［24］，因此pyrG突变后即获得了5-FOA抗性，并对尿嘧啶核苷形成依赖。实验结果表明，获得的4株pyrG突变株能够在添加5-FOA的培养基上正常生长，并且未出现明显的生长发育差异，这样突变株与生产用菌株的形态差异很小，比较容易被生产上接受。经化学成分分析显示，添加尿嘧啶核苷能够显著增加野生型红曲霉的洛伐他汀和色素含量，同时显著降低桔霉素含量，符合红曲霉菌种对这3种成分的研发要求。

因pyrG突变会导致内源性尿嘧啶核苷的合成减少，理论上突变株将比野生型的洛伐他汀和红曲色素含量减少，桔霉素含量增加。当在添加尿嘧啶核苷的培养条件下比较突变型与野生型菌株，结果显示：（1）洛伐他汀在9个变异株中均有增加，与推测结果相反，可能与添加20 g/L尿嘧啶核苷的剂量过高有关，导致突变株的洛伐他汀含量未减少，同时来自红曲色素、桔霉素等其他聚酮类化合物的代谢流可能也有弥补作用。（2）红曲色素含量在4个变异株中有增加，在5个菌株中不同程度减少，增减比较随机。考虑到红曲色素包含安卡黄素、梦那红、潘红胺等多种组分，且易受光照等环境因素的影响，因此推测突变株中红曲色素的含量变化与pyrG基因突变没有很明显的相关性。（3）桔霉素含量在7个变异株中显著增加，与推测结果一致，但另外2个变异株的桔霉素含量未增反降，可能与sgRNA的非特异性打靶有关，另外，不同变异菌株之间的个体差异也会产生影响。因为洛伐他汀、红曲色素和桔霉素皆属于聚酮类化合物，其主干代谢途径较一致，代谢流之间存在相互联系，而尿嘧啶核苷对三者的作用却并不相同，因此推测尿嘧啶核苷对代谢流的影响可能发生在桔霉素的分支代谢途径上，导致桔霉素减少时，增加了洛伐他汀的代谢流。

本研究成功构建了体外sgRNA对红曲霉Cas 9底盘菌株定向基因编辑的技术体系，并获得pyrG突变株，为大量研究红曲霉的基因功能奠定了基础，也为研究其他真菌提供参考。补充尿嘧啶核苷能够提高洛伐他汀和红曲色素的含量，同时降低了桔霉素的含量，因此该研究对红曲产品的生产有一定的指导价值。

4 结论

利用表达Cas 9的红曲霉作为底盘菌株，通过原生质体导入外源sgRNA可以实现快速基因编辑，为重复使用底盘菌株开展大规模基因研究提供了技术参考。通过pyrG基因编辑发现，外源或内源尿嘧啶核苷的含量变化对红曲霉桔霉素的含量有较大影响。