miR-383和PRDX3在结肠癌组织中的表达水平及意义

杨学丽，姜琳娜，安 欣，吴倩岚，江现丽，魏 娉，李智峰

邯郸市第一医院：1.病理科；2.普外科，河北邯郸 056002

结肠癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，手术切除辅以放化疗是主要的治疗方式，但术后易转移复发，病死率高，严重危害人类的生命健康[1]。因此研究结肠癌的发生、发展机制，寻找可早期提示预后的分子标志物具有重要意义。微小RNA-383(miR-383)与多种肿瘤的发生、发展相关，研究表明，胶质瘤内皮细胞中miR-383表达明显下调，miR-383过表达能显著抑制内皮细胞的增殖、迁移，以及小管形成和球状血管生成[2]。崔盈等[3]研究表明，miR-383在结肠癌组织中表达降低，上调miR-383表达对结肠癌细胞具有抑制增殖和降低侵袭及迁移能力的作用。硫氧还蛋白依赖的过氧化物还原酶3(PRDX3)为一类存在于细胞线粒体中的过氧化物酶，通过调节细胞内活性氧化物水平，参与细胞增殖、分化与凋亡，对肿瘤的发生、发展起着重要作用。丁妍等[4]研究表明，PRDX3在食管鳞状细胞癌中表达水平升高，且与肿瘤的分期分级、淋巴结转移呈正相关。然而，目前miR-383与PRDX3同时在结肠癌中的研究报道不多。本研究通过检测miR-383与PRDX3在结肠癌组织中的表达情况，探讨miR-383和PRDX3在结肠癌中的表达水平及临床意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2016年5月至2018年6月在本院确诊为结肠癌患者的结肠癌组织标本85份，其中男44例，女41例；年龄32～88岁，平均(58.50±12.60)岁；<60岁38例，≥60岁47例；肿瘤最大径<50 mm者40例，≥50 mm者45例；肿瘤分化程度：低分化35例，中、高分化50例；TNM分期[5]：Ⅰ～Ⅱ期者37例，Ⅲ～Ⅳ期者48例；浸润深度：T1/T2 39例，T3/T4 46例；有淋巴结转移47例，无淋巴结转移38例。纳入标准：(1)符合结肠癌诊断标准[5]，且病理学检查确诊；(2)每份标本临床、病理资料完整；(3)所有患者均为初次诊断，术前均未行任何抗肿瘤治疗。排除标准：(1)合并严重心、肝、肺、肾功能不全；(2)合并其他系统的恶性肿瘤者；(3)临床资料不全者。另选取同期88例行肠镜检查人员的正常结肠黏膜组织标本作为对照，其中男45例，女43例；年龄31～86岁，平均(57.97±12.27)岁。研究标本采集均经过医院伦理委员会批准，患者及其家属均签署知情同意书。

1.2主要试剂与仪器 RNA提取试剂盒(批号76205)购自德国Qiagen公司；逆转录试剂盒(批号K5076)和聚合酶链式反应(PCR)试剂盒(批号K7009)购自美国Thermo Fisher公司；免疫组织化学试剂盒(批号ab30556)、PRDX3鼠抗人单克隆抗体(批号ab70224)购自美国Abcam公司；实时荧光定量PCR(qRT-PCR)仪(型号LightCycler480)购自罗氏诊断产品(上海)有限公司；显微镜(型号DMI8)购自德国徕卡公司。

1.3研究方法

1.3.1标本采集及保存 采用RNA提取试剂盒从冰冻的结肠癌组织及正常结肠黏膜组织标本中提取总RNA，用DNA酶去除DNA，检测RNA浓度与纯度，反转录得到cDNA，置于-20 ℃保存备用。将另外一部分结肠癌组织及正常结肠黏膜组织标本做成石蜡切片，用于免疫组织化学染色。

1.3.2qRT-PCR检测miR-383、PRDX3信使核糖核酸(mRNA)的表达水平 采用qRT-PCR检测miR-383、PRDX3 mRNA的表达水平，miR-383、PRDX3 mRNA及内参基因U6、β-actin引物序列由上海吉玛公司设计与合成，引物序列见表1。反应体系20 μL，反应条件：95 ℃，75 s；95 ℃，15 s；60 ℃，75 s；95 ℃，15 s；40个循环。每个样品设置3个复孔。反应结束后，采用2-ΔΔCt分析法计算相对表达水平。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3免疫组织化学染色 将石蜡切片后，经过脱蜡、抗原修复和去除内源性过氧化物酶活性后，加10%山羊血清封闭，PRDX3鼠抗人单克隆抗体(工作浓度1∶100)，于4 ℃过夜，DAB染色，苏木精复染细胞核，封片，显微镜观察。染色结果判断：PRDX3抗体定位于细胞胞质或出现于细胞膜上，出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞。阳性细胞数：<5%，记为0分；5%～<25%，染色淡黄色，记1分；25%～<50%，染色黄色，记2分；50%～75%，染色棕黄色，记3分；>75%，染色棕褐色，记4分；根据阳性细胞染色强度判定，细胞无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。将两者积分的乘积作为评判标准[6]：得分0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，6和8分为阳性(++)，9分及以上为强阳性(+++)。统计时将弱阳性、阳性、强阳性计算为阳性结果。

1.4预后随访 术后对所有患者进行电话或门诊随访，随访期限是3年，随访起始时间为术后第1天，随访截止日期为2021年6月30日，观察患者生存情况，患者无失访。

2 结 果

2.1结肠癌组织与正常结肠黏膜组织中miR-383及PRDX3 mRNA表达水平比较 与正常结肠黏膜组织比较，结肠癌组织中miR-383表达水平显著降低，PRDX3 mRNA表达水平显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 结肠癌组织与正常结肠黏膜组织中miR-383及PRDX3 mRNA表达水平比较

2.2结肠癌组织与正常结肠黏膜组织中PRDX3蛋白阳性表达率比较 免疫组织化学染色结果显示，PRDX3蛋白主要定位于细胞膜与细胞质，结肠癌组织中PRDX3蛋白阳性表达率显著高于正常结肠黏膜组织，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1、表3。

表3 结肠癌组织与正常结肠黏膜组织中PRDX3蛋白阳性表达率比较

图1 结肠癌组织与正常结肠黏膜组织中PRDX3表达(×200)

2.3结肠癌组织中miR-383和PRDX3 mRNA表达水平的相关性 结肠癌组织中miR-383表达水平和PRDX3 mRNA呈负相关(r=-0.616，P<0.001)，见图2。通过TargetScanHuman软件预测显示，miR-383和PRDX3存在靶向结合位点，见图3。

图2 结肠癌组织中miR-383和PRDX3 mRNA关系的散点图

图3 miR-383和PRDX3靶向关系预测

2.4miR-383和PRDX3表达水平与结肠癌临床病理特征的关系 以结肠癌组织中miR-383表达水平的平均值(0.67)为界，将结肠癌患者分为miR-383高表达组(≥0.67)42例和miR-383低表达组(<0.67)43例；以PRDX3蛋白免疫组织化学染色结果将结肠癌患者分为PRDX3高表达组(染色结果为++和+++)43例和PRDX3低表达组(染色结果为-和+)42例；分析发现，miR-383、PRDX3表达水平与患者性别、年龄、肿瘤最大径、浸润深度无关(P>0.05)，与肿瘤分化程度、TNM分期和淋巴结转移有关(P<0.05)，见表4。

表4 miR-383和PRDX3表达水平与结肠癌临床病理特征的关系[n(%)]

2.5miR-383和PRDX3表达与结肠癌患者生存率的关系 随访3年，患者生存44例，死亡41例；通过Kaplan-Meier生存分析可知，miR-383高表达组结肠癌患者3年累积生存率28/42(66.67%)显著高于miR-383低表达组16/43(37.21%)(χ2=5.903，P=0.015)；PRDX3高表达组结肠癌患者3年累积生存率17/43(39.53%)显著低于PRDX3低表达组27/42(64.29%)(χ2=5.213，P=0.022)，见图4。

图4 Kaplan-Meier生存分析注：A为不同miRNA-383表达水平结肠癌患者生存曲线；B为不同PRDX3表达水平结肠癌患者生存曲线。

2.6结肠癌患者预后影响因素分析 Cox回归模型单因素分析结果显示，影响结肠癌患者不良预后危险因素为低分化、淋巴结转移、miR-383低表达、PRDX3高表达(P<0.05)，而性别、年龄、肿瘤最大径、TNM分期、浸润深度与结肠癌患者预后无关(P>0.05)；多因素分析结果显示，结肠癌低分化、淋巴结转移、miR-383低表达、PRDX3高表达是结肠癌患者不良预后的独立危险因素(P<0.05)，见表5。

表5 影响结肠癌患者不良预后的危险因素分析

3 讨 论

结肠癌是我国常见的恶性肿瘤，发病率呈逐年升高趋势，尤以中老年人发病居多，是影响生命安全的主要恶性肿瘤之一[7]。研究结肠癌的发病机制，对寻找其有效治疗手段和预后评估方法具有重要意义。miRNAs在细胞增殖、分化、生长、发育等多种过程中发挥重要作用，其表达异常与多种肿瘤发生发展有关[8-9]。研究表明，miR-383在多种肿瘤组织或细胞中表达下调，可影响肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移[10-12]。WAN等[13]研究结果表明，miR-383通过干扰素调节因子1，参与调节胆管癌细胞的增殖、迁移和侵袭。ZHU等[14]研究表明，miR-383在胃癌组织中表达显著降低，且与胃癌患者的晚期进展相关，功能分析表明，miR-383过表达可抑制胃癌细胞增殖并促进其凋亡。研究结果显示，miR-383在结肠癌组织与细胞中低表达，发挥抑癌基因的作用，上调miR-383表达可抑制结肠癌细胞的增殖、迁移与侵袭[15-16]。最新研究结果显示，miR-383表达与结肠癌TNM分期和淋巴结转移有关[17]。本研究结果显示，在结肠癌组织中miR-383表达水平低于正常结肠黏膜组织，与以往报道结果类似[15-16]。本研究分析发现，miR-383表达与TNM分期及淋巴结转移有关，与赵亮等[17]研究结果一致，本研究还发现，miR-383表达与结肠癌分化程度有关，提示miR-383可能与结肠癌发生、发展有关，miR-383可能通过参与调控结肠癌细胞的增殖、迁移与侵袭而参与结肠癌的发生、发展。

PRDX3作为PRDXs家族成员之一，在细胞抗氧化及细胞增殖分化等生理病理过程中具有重要作用，有研究表明，PRDX3在多种肿瘤组织中存在高表达[18-19]。陈锡彬等[6]研究表明，PRDX3在前列腺癌组织中表达比良性前腺增生组织中高，有可能成为鉴别前列腺癌与良性前列腺增生的新型肿瘤标记物。SHI等[20]研究表明，PRDX3在肝细胞癌患者血清中表达水平升高，血清PRDX3表达水平与甲胎蛋白水平、肿瘤直径、TNM分期和门静脉侵犯密切相关，与患者生存率呈负相关。BYUN等[21]研究表明，与正常子宫内膜组织比较，PRDX3在子宫内膜癌中高表达，可能与预后不良有关。张大伟等[22]研究显示，PRDX3在结肠癌组织中阳性表达率为63.16%，且与肿瘤最大径、浸润深度、脉管内瘤栓密切相关。本研究结果显示，结肠癌组织中PRDX3 mRNA表达水平显著高于正常结肠黏膜组织，且结肠癌组织中PRDX3蛋白阳性表达率为64.71%，高于正常结肠黏膜组织的29.55%，这与张大伟等[22]研究结果一致。本研究分析了PRDX3与临床病理特征的关系，结果显示，PRDX3表达水平与肿瘤分化程度、TNM分期和淋巴结转移有关，提示PRDX3可能促进结肠癌的发生、发展。

王少增等[23]研究表明PRDX3在人髓母细胞瘤组织、人髓母瘤细胞系中存在过表达情况，而miR-383可能通过下调PRDX3表达水平来抑制人髓母瘤细胞系的增殖，并促进其凋亡。本研究结果显示，结肠癌组织中miR-383表达水平和PRDX3 mRNA呈负相关，经TargetScanHuman软件预测显示，miR-383和PRDX3存在靶向结合位点，提示miR-383靶向调控PRDX3促进结肠癌的发生、发展。本研究还发现，miR-383高表达组结肠癌患者3年累积生存率显著高于miR-383低表达组患者；PRDX3高表达组结肠癌患者3年累积生存率显著低于PRDX3低表达组患者，提示miR-383、PRDX3可能通过调控肿瘤发展影响患者预后情况。进一步研究发现，结肠癌低分化、淋巴结转移、miR-383低表达、PRDX3高表达是结肠癌患者不良预后的独立危险因素，提示miR-383、PRDX3可能作为评估结肠癌患者不良预后的生物标志物。

综上所述，结肠癌组织中miR-383低表达、PRDX3高表达，且与患者肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移及生存情况有关，可能作为结肠癌患者预后评估的分子标志物。