支气管哮喘合并肺炎支原体感染患儿糖皮质激素受体α、β mRNA表达检测及其与血清炎症因子、肺功能相关性分析

谢 勇，郭丽丽

(1.榆林市星元医院儿科，陕西 榆林 719000；2.榆林市第一医院儿科，陕西 榆林 719000)

支气管哮喘的主要特征是患者气道出现慢性炎症反应，好发于儿童，是威胁儿童健康的常见疾病之一，临床症状表现为气急、咳嗽、胸闷等，均易反复发作[1]。目前该病的发生机制还不明确，不过近年来有关病原体感染与支气管哮喘发病关系的研究得到广泛重视。肺炎支原体是一种原核细胞型、无细胞壁的微生物，不需要细胞培养基，通过呼吸道飞沫和直接接触传播，能独自胞外生长[2-3]。现代研究[4-5]表明，支气管哮喘合并肺炎支原体感染发病的关键机制是Th1/Th2平衡失调，因此该疾病属于一种免疫失衡性疾病。糖皮质激素(Glucocorticoid，GC)是由肾上腺皮质束状带分泌的类同醇类内分泌激素，能介导T淋巴细胞的激活和淋巴因子的产生，从而产生抑制炎症反应、快速控制支气管哮喘症状的作用[6-7]。GC在体内主要与糖皮质激素受体(Glucocorticoid receptor，GR)特异性结合才能发挥作用，后者属于核受体超家族的一个亚家族[8]。GR在有核细胞中广泛表达，从而在机体代谢、分化及发育中发挥重要作用[9-10]。GR主要有2个亚型，即GR-α和GR-β。本研究主要探讨支气管哮喘合并肺炎支原体感染患儿GR-α和GR-β mRNA的表达情况，并分析其与血清炎症因子、肺功能的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2019年2月到2021年4月我院接诊的支气管哮喘合并肺炎支原体感染患儿、单纯支气管哮喘患儿及同期体检健康的儿童各54例，分别纳入合并组、单纯哮喘组和对照组。三组一般资料比较差异无统计学意义(均P>0.05)，见表1。病例纳入标准：合并组患儿均符合支气管哮喘合并肺炎支原体感染的诊断标准；单纯哮喘组患儿均符合支气管哮喘的诊断标准；年龄1～8岁。排除标准：合并其他系统性疾病；有过敏性疾病史；免疫功能低下；低出生体重；先天性气道畸形。本研究经医院伦理委员会批准实施。患儿家属均对本研究知情同意并签署知情同意书。

表1 三组一般资料比较

1.2 研究方法

1.2.1 GR-α、GR-β mRNA表达检测：采集所有儿童的咽拭子样本，按核酸同步抽提试剂盒(批号：48814221，Qiagen公司)要求提取核酸，测定纯度及浓度。检索NCBI Gene Bank数据库，应用Bio-Edit软件设计GR-α、GR-β引物(GR-α正向序列为5’-CCCAGTGAATCCAGACAAGT-3’，反向序列为5’-GTGTATCCAATCACCTATGAG-3’；GR-β正向序列为5’-CCAAGCTGATCCCAAAGGGAC-3’，反向序列为5’-CCATCGGGCATCCAATITCC-3’)。由大连TAKARA公司进行引物合成，采用qPCR方法检测GR-α、GR-β mRNA相对表达水平，以β-actin作为扩增内对照组。

1.2.2 血清炎症因子含量检测：抽取三组儿童空腹静脉血2～3 ml，采用EDTA抗凝后在4 ℃条件下以3000 r/min离心10 min，取上清后保存于-80 ℃冰箱。肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-13(IL-13)、C-反应蛋白(CRP)等炎症因子含量使用酶联免疫吸附法(ELISA)进行检测(试剂盒批号：28848001、37714222、61975244、89138842，上海生工公司)。

1.2.3 临床资料调查：采用自行设计的统一问卷调查表，对所有患儿的性别、年龄、体重、身高、吸气时间、呼气时间、第一秒用力呼气容积(FEV1)、FEV1/用力肺活量(FVC)等指标。

1.3 观察指标 ①比较三组GR-α、GR-β mRNA表达水平；②比较三组血清炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-13、CRP)表达水平；③比较三组肺功能指标[吸气时间、呼气时间、第一秒用力呼气容积(FEV1)及FEV1/FVC]水平；④分析GR-α、GR-β mRNA表达与炎症因子、肺功能的相关性。

2 结 果

2.1 三组GR-α、GR-β mRNA相对表达水平比较 见表2。合并组与单纯哮喘组GR-α、GR-β mRNA相对表达水平高于对照组，且合并组高于单纯哮喘组(均P<0.05)。

表2 三组GR-α、GR-β mRNA相对表达水平比较

2.2 三组血清炎症因子含量比较 见表3。合并组与单纯哮喘组血清TNF-α、IL-6、IL-13含量高于对照组，且合并组高于单纯哮喘组(均P<0.05)。三组血清CRP含量比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 三组血清炎症因子含量比较

2.3 三组肺功能比较 见表4。合并组与单纯哮喘组吸气时间低于对照组，且合并组低于单纯哮喘组(均P<0.05)。三组呼气时间、FEV1、FEV1/FVC比较差异无统计学意义(均P>0.05)。

表4 三组肺功能比较

2.4 合并组患儿GR-α、GR-β mRNA相对表达水平与炎症因子、肺功能相关性分析 见表5。Pearson相关性分析显示，合并组患儿GR-α、GR-β mRNA相对表达水平与血清TNF-α、IL-6、IL-13含量呈正相关，与吸气时间呈负相关(均P<0.05)。

表5 合并组患儿GR-α、GR-β mRNA相对表达水平与炎症因子、肺功能的相关性

3 讨 论

支气管哮喘是以T淋巴细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞浸润为主，伴有巨噬细胞和淋巴细胞等参与调节的气道慢性、反复发作性疾病[11-12]。肺炎支原体为一种非典型病原体，也是患儿呼吸道感染的重要病原体，为导致支气管哮喘发作的一个重要因素[13]。GR-α、GR-β属于核受体超家族的重要成员，都为典型的激素依赖性转录调节因子，主要存在于有核细胞中。GR-α、GR-β为GR基因同一转录产物经不同剪切方式而产生，其中GR-α在多数细胞中的含量超过GR-β，且GC主要通过结合GR-α发挥作用[14]。本研究显示，合并组与单纯哮喘组的GR-α、GR-β mRNA相对表达水平高于对照组，且合并组高于单纯哮喘组。从机制上分析，GR-α、GR-β表达增加可使得其与GC的亲和力显著下调，有利于增加局部淋巴细胞增殖、活化及细胞因子的产生和释放，导致机体产生免疫损伤，从而使患儿处于免疫紊乱状态，导致病情恶化[15-16]。

支气管哮喘的三大特征是气道炎症、气道高反应性及气流受限，其中支气管哮喘的病理基础是气道炎症，因为炎症因子过量释放会导致支气管哮喘的发生与发展[17]。IL-6、IL-13由机体内的淋巴和非淋巴组织细胞产生，可参加炎症介质的级联反应。TNF-α可促进形成逐级放大的瀑布样连锁反应，诱导组织细胞损害，因此被认为是引起支气管哮喘的重要细胞因子之一[18]。本研究显示，合并组与单纯哮喘组的血清TNF-α、IL-6、IL-13含量高于对照组，且合并组高于单纯哮喘组。从机制上分析，肺炎支原体感染可通过其特殊结构紧密黏附于一些宿主细胞膜的受体上，导致机体清除病原体的能力减弱，同时释放有害的代谢产物，使宿主细胞受损；并且肺炎支原体感染可影响免疫细胞分泌细胞因子而参与支气管哮喘的发病[19]。

通过肺功能动态观察能够较准确地评估支气管哮喘患儿的气道受损程度，从而减少支气管哮喘对患儿的危害程度，同时还可以减少支气管哮喘的发病率[20]。本研究显示，合并组与单纯哮喘组吸气时间低于对照组，且合并组低于单纯哮喘组；三组呼气时间、FEV1、FEV1/FVC比较差异无统计学意义。究其原因，肺炎支原体感染可导致机体出现支气管上皮受损，进而出现小气管收缩，从而降低患儿的吸气时间。Pearson相关性分析显示，支气管哮喘合并肺炎支原体感染患儿的GR-α、GR-β mRNA相对表达水平与TNF-α、IL-6、IL-13含量呈正相关，与吸气时间呈负相关。从机制上分析，支气管哮喘合并肺炎支原体感染是一种患儿常见的呼吸系统疾病，也是一种由多种免疫细胞参与的慢性气道变应性炎症性疾病。GC可以通过与GR结合产生抗炎作用。当机体突然停用高效GC制剂后，GR与GC的亲和力下降，致使内源性GC不能很好地发挥其生物效应，引起细胞因子、炎症介质释放增加，导致机体容易受到感染侵袭。

综上所述，支气管哮喘合并肺炎支原体感染患儿多呈现GR-α、GR-β mRNA的高表达，而GR-α、GR-β mRNA相对表达水平与患儿血清炎症因子、肺功能密切相关。但本研究也有一定的不足，病例人数比较少，且指标相对单一，下一步将增加样本量和相关指标进行更深入的分析。