391714例新生儿先天性肾上腺皮质增生症筛查与基因检测

徐钰琪 林彩娟 耿国兴 李威 阳奇 罗静思

1广西壮族自治区妇幼保健院遗传代谢中心实验室（南宁 530012）；2广西出生缺陷预防控制研究所（南宁 530012）；3广西生殖健康与出生缺陷防治重点实验室（南宁 530012）

先天性肾上腺皮质增生症（CAH）是一种常染色体隐性遗传病，是由于肾上腺皮质在合成人体必需的盐皮质激素、糖过程中，某些酶（21-羟化酶、11β-羟化酶、3β-羟类固醇脱氢酶等）的先天性缺陷导致的肾上腺皮质功能减退，其中，21-羟化酶最常见，约占90%以上［1］，可在生后2 周内出现严重失盐症状、甚至死亡；同时，CAH 还可造成体内雄性激素水平的异常增高，导致女性男性化及男性假性性早熟、成年后身材矮小等。因CYP21A2 基因缺陷会引起CYP21（21-羟化酶）活性丧失，CAH 患儿体内17-羟孕酮（17-OHP）水平会明显升高，因此早期进行新生儿疾病筛查联合CYP21A2 基因检测可有效检出患儿，减轻CAH 导致的严重后果。为了解本地区的CAH 筛查情况与21-OHD 热点变异位点及基因检测结果，回顾分析近7年来的临床资料，以期提高对新生儿CAH 筛查的认识和阳性患儿的诊治能力，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料2015-2021年在广西新生儿疾病筛查中心管辖范围内的168 家助产医院出生的391 714 例活产新生儿为研究对象，按照《新生儿疾病筛查血片采集技术规范》的要求采集足跟血，送至广西新生儿疾病筛查中心行17a-OHP 浓度值检测。采用EDTA抗凝管抽取患儿及其父母外周血各2 mL，提取DNA，采用Sanger 测序和MLPA（多重连接探针扩增技术）行CYP21A2基因检测。本研究通过广西壮族自治区妇幼保健院伦理委员会批准，所有检查均征得患儿家属或监护人签署同意告知书。

1.2 研究方法

1.2.1 CAH 筛查新生儿CAH 筛查常用的是时间分辨免疫荧光法［2］，2015年1月至2019年8月切值根据试剂盒说明书≥30 nmol/L 为阳性，2019年9月起试剂盒升级后切值调整为17-OHP 检测值≥11 nmol/L 的足月儿（≥37 周）、早产儿（＜37 周）17-OHP 检测值≥26 nmol/L 者为阳性，对于可疑的新生儿，进行二次召回复查血片行下一步的确诊。

1.2.2 CAH 诊断中华医学会儿科学分会内分泌遗传代谢病学组在《先天性肾上腺皮质增生症21-羟化酶缺陷诊治共识》提出CAH 诊断临床谱带宽，主要依据临床表现、内分泌激素检查和影像学相关辅助检查综合判断，必要时应用基因诊断［2］。（1）临床表现：失盐表现（低钠低血容量的休克）、高雄激素血症（不同年龄表现不一，女性男性化、男性性早熟）及皮肤或黏膜色素加深，以乳晕和外阴明显，部分婴儿可无此改变。（2）辅助检查：17-羟孕酮增高；血清皮质醇低下伴ACTH 增高（也有21-OHD 患者皮质醇正常）；雄激素升高（需按照年龄、性别和青春期发育判断不同的参考值）；出生性别模糊者行B 超检查明确有无子宫及性腺；外生殖器畸形者行染色体核型分析；由于临床谱带宽，对临床不能诊断21-OHD 或者需与其他疾病鉴别时，必须做基因诊断确诊，可以联合Sanger 测序和MLPA 技术进行CYP21A2 基因诊断。

1.3 统计学方法资料采用Excel 软件录入资料整理，计数资料以例数和百分数表示。

2 结果

2.1 新生儿CAH 筛查情况2015-2021年间，辖区内新生儿活产数共计1 014 108 例，CAH 共筛查391 714 例，总筛查率为38.63%。CAH 筛查阳性1 769 例，阳性率为0.45%，确诊CAH 患儿21 例，发病率为1/18 653（0.053 6‰），见表1。发病情况与全国各地区相比较存在差异，见表2。

表1 2015-2021年新生儿CAH 筛查及确诊情况Tab.1 Screening and diagnosis of neonates CAH from 2015 to 2021

表2 广西与各地区CAH 发病情况的比较Tab.2 Comparison of CAH incidence between Guangxi and other regions

2.2 确诊CAH 患儿情况

2.2.1 病例资料确诊的21 例CAH 患儿中，平均胎龄为37+5周，诊断平均年龄9.86 d，最小2 d，最大27 d。初筛血17-OHP 浓度在31～972 nmol/L 之间，见表3。

2.2.2 CYP21A2基因检测结果21例患儿中除2例因放弃治疗未行基因检查外，其余19 例均对CYP21A2 基因进行检测，所有确诊患儿均发现相关基因变异，同时对患儿父母进行验证，检测到父母相同等位基因上CYP21A2 变异。见表3。

表3 21 例CAH 患儿临床资料Tab.3 Clinical data of 21 children with CAH

3 讨论

先天性肾上腺皮质增生症（CAH）是由于肾上腺皮质激素合成过程中酶缺陷引起的常染色体遗传病，其中以编码21-OHD 的CYP21A2 基因的变异最常见，新生儿疾病筛查主要针对21-羟化酶缺乏筛查，由于21-羟化酶缺乏，肾上腺皮质激素生物合成通路受阻，导致对垂体促肾上腺皮质激素分泌的负反馈抑制作用减弱，从而使肾上腺皮质激素前体物质17-羟孕酮堆积，血17α-OHP 的升高是21-OHD 早期诊断的特异性指标和主要监测指标。

我国目前的CAH 筛查率是30%～35%［8］，本新筛中心通过不断的推广与宣传，筛查率从2015年的33.6%到2021年的42.9 %，呈逐年上升的趋势，但整体筛查率也较低，要努力通过多渠道提高筛查率。全世界CAH发生率约为1/10 000～1/20 000［9-13］，本研究中CAH 发生率为1/18 653，与国内报道的相比较，发病率低于重庆1/18 000［14］，江苏宿迁1/17 298［7］，山东淄博1/16 234［3］，宁夏1/14 550［15］，高于上海1/18 795［16］，江西宜春1/20 076［4］，江苏扬州1/22 207［5］，四川1/32 326［6］。本研究通过对391 714例新生儿筛查，在筛查阳性样本召回的1 559 例新生儿中检出21 例患儿，阳性预测值为1.37%，与全国各地区对比，也有差异，有文献报道［17-20］，新生儿17α-OHP 浓度水平与其出生体质量、胎龄、用药、营养、地域、采血时间等因素有关，不同胎龄的出生低体重儿与正常体重儿的17α-OHP 浓度有差异，早产儿的浓度会高于足月儿，这样就会造成假阳性过多，只用一个切值去判断阴阳性会对结果造成误判，增加不必要的召回压力及家长的焦虑，所以在17α-OHP 的免疫测定中应该制定不同影响因素下的切值，提高确诊率。也有研究报道，液相色谱-串联质谱技术可将CAH 筛查的阳性预测值提高30%～100%［21］。但是由于该技术标本处理操作复杂，自动化程度低，目前还未能大规模运用于临床。在本研究病例中，21 例患儿检出年龄在2～27 d，真正做到了在患儿出现严重症状前对婴儿早期诊断并及时治疗和规范化管理，大大降低新生儿肾上腺危象对患儿的影响及性别的错误判断，降低病死率。

CAH 发病率低，临床表现复杂缺乏特异性，不易察觉且易误诊漏诊，17α-OHP 升高可高度提示21-OHD，基因检测则可对其确诊。CAH 的致病基因是21-羟化酶基因，该基因位于人类第6 号染色体短臂6p21.3 的HLA Ⅲ类基因区。21-羟化酶CYP21A2 基因的变异鉴定是在联合Sanger 测序和MLPA 技术从分子水平进行分析，是对筛查结果的确诊与补充；基因测序能检出基因点突变，但对大片段缺失和重复可能漏诊，MLPA 可同时检测多个不同核苷酸序列的缺失重排及拷贝数变化，联合两种技术可取长补短明显提高该基因的阳性率。根据人类基因变异数据库发现，迄今引起CYP21A2 基因的变异大约有300 种［22］，一般分为3 种类型：（1）点变异；（2）大片段基因缺失和基因转换；（3）自发变异。所以本病在近亲结婚的后代中发病率相对较高。90%的CAH是由于21-OHD活性丧失所致，基因变异程度越重，酶活性越低，表现出越重的肾上腺危象，出生早期就会发生严重的电解质紊乱和性分化异常；本研究病例中，有两例患儿的17α-OHP 浓度高达914 nmol/L 和818 nmol/L，临床表现为严重的高钾低钠、脱水、假两性畸形，皮肤色暗合并严重的呼吸衰竭、病情恶化危重，临床症状支持CAH 的诊断，最终因家属放弃治疗，未能行基因检测；其余19 例患儿经基因检测发现均存在CYP21A2 基因的不同变异，发现了多种变异类型：剪接变异、错义变异、无义变异和大片段缺失等。在检出的外显子缺失中，E1-E7 缺失患儿的17α-OHP 浓度为955 nmol/L，E1-E3 缺失患儿的17α-OHP 浓度为972 nmol/L 和398 nmol/L，E3-E4缺失患儿的17α-OHP 浓度为604 nmol/L，平均浓度为732.25 nmol/L，其他点突变的患儿17α-OHP 浓度相对较低，这可能与残余酶活性有关，CYP21A2基因的不同突变可使得CYP21 活性丧失不同，突变程度越重，症状也越重。但仍有少数酶缺失与基因型表型不一致的情况，其原因可能与新生儿出生时激素水平不稳定，采血时间等因素影响了酶活性有关。

在基因突变频率方面，19 例患儿中检出6 例c.293-13A/C＞G，占比33%，4例IVS2-13A/C＞G，占比22.2%，3 例c.518T＞A（p.I173N），占比16.67%，2 例c.955C＞T ，占比11.11%及外显子缺失；由此发现，CYP21A2 基因变异的类型多样化，c.293-13A/C＞G是本地区的热点变异，与国内报道的四川省［23］、河南省［24］、湖南［25］、徐州［26］检出的热点变异位点一致，也是国内较常见的变异位点；其次为IVS2-13A/C＞G ，这两种点突变I2G 导致RNA 剪接发生异常，引起纯合突变或杂合突变，在本组病例中剪接突变占55.2%。与国外相关的基因检出情况对比发现，CYP21A2 基因有地区和种族之间的差异［27-28］，不同群体间的基因变异谱和热点频率不尽相同，越南［29］对212 例患者分析发现以缺失变异为主，第二位才是c.293-13A/C＞G 变异；FINKEL STAIN 等［30］报道的166 例患者亦是如此。联合Sanger 测序和MLPA 技术对CYP21A2 基因变异的应用在是一种特异、可靠的基因检测手段，能有效检出基因变异和大片段缺失，对本组病人检出率高。湖南［25］地区通过对48 例确诊21-羟化酶缺乏症患儿行基因检测中，检出基因阳性44 例，阳性率为91.7%；杨海花等［24］对55 例患儿行基因检测中，检出基因阳性53 例，阳性率为96.36%；不排除某些新发变异未被检出，还需要进一步的验证。

综上，CAH 作为一种遗传性疾病，初次筛查阳性的新生儿，需进一步确诊。以ELISA、TRFIA 作为CAH 一级筛查方法的，确诊时需补充生化检测，典型的21-OHD 表现较为显著，且也相对较容易进行诊断，而对于临床疑似而生化诊断困难者，或诊断不明已用糖皮质激素的非典型的21-OHD，一般只表现出轻微的高雄激素体征，难与类似症状的疾病鉴别，因此，有必要借助基因诊断来明确。本研究通过对CYP21A2 基因检测来明确本病的基因型，因此通过CYP21A2 基因检测进一步证实了临床和生化诊断；基因检测是CAH 确诊的金标准，由于CYP21A2 与无功能的假基因CYP21A1的高度同源，CYP21A2 基因结构性变异的复杂性，有必要进行父母的CYP21A2 分析和测序，用于确定突变情况，通过联合Sanger 测序和MLPA 技术对胎儿进行检测，根据父母或先证者的基因检测结果，判断胎儿的基因型，可以有效避免拷贝数变异所导致的误诊，指导临床治疗及判断预后，更为重要的是，根据遗传规律能够对患儿父母的再生育风险提供前瞻性指导。本研究也存在不足之处，由于病例数有限且确诊的病例均是新生儿，缺少成人的相关病例，对本地区的21-OHD 和CYP21A2基因变异结果分析可能造成偏差，为了获得更准确的获得基因谱，有待进一步扩大研究对象累积相关病例。