青少年发病的成人型糖尿病2型的临床与分子遗传学研究

周知子 李秀珍 徐爱晶 梅慧芬 林云婷 曾春华 毛晓健 饶敏 刘丽

广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心遗传与内分泌科（广州 510623）

青少年发病的成人型糖尿病（maturity-onset diabetes of the young，MODY）是一类具有高度遗传异质性的单基因遗传病，常在25 岁前诊断。目前为止，根据致病基因分14 种亚型，其中由葡萄糖激酶（glucokinase，GCK）基因变异引起的MODY2（又称GCK-MODY），呈常染色体显性遗传，是最常见的一种亚型［1］。欧洲流行病学调查结果显示［2］MODY2 的患病率达1/1 000，国外多个研究显示［3］MODY2 占MODY 的比例约为10%～60%。近期有研究指出［5］，MODY2 在中国成人糖尿病人群中的患病率约为1.3%［4］，约占MODY 的18.42%。目前对于中国儿童MODY2 的临床特征了解甚少，缺乏GCK 基因型-临床表型关系的研究，临床医生对本病认识不足，误诊率、误治率高，尤其是婴儿期起病的患儿，早期识别并准确诊断有助于制定合理、个性化的治疗策略，减少过度医疗及不良反应，进而优化家族中其他MODY2 患者的治疗方案。本课题组此前报道［6］1 例男性患儿被误诊为1 型糖尿病，予胰岛素治疗半年后才确诊为MODY2，为了提高对MODY2 儿童患者的诊断和管理水平，本文对近年来于广州市妇女儿童医疗中心临床诊断并经基因确诊的32 例MODY2 儿童进行临床特征分析与分子遗传学研究。

1 资料与方法

1.1 研究对象2011年4月至2021年10月在广州市妇女儿童医疗中心内分泌科就诊，临床诊断为MODY2 的无症状高血糖儿童。MODY2 的临床诊断标准根据国际青少年糖尿病协会（ISPAD）指南［7］：（1）无糖尿病症状，空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）5.5～8.3 mmol/L，糖化血红蛋白（glycosylated hemoglobin A1c，HbA1c）≤7.5%；（2）胰岛β 细胞自身抗体阴性；（3）父亲或母亲有糖尿病病史，但无临床症状或高血糖引起的并发症，轻度的FPG 升高（5.5～8.3 mmol/L）。32 例患儿分别来自30 个无血缘关系的家庭，父母非近亲婚配，病例14、病例15 为同胞兄妹，病例25、病例27 为同胞兄弟。其中男19 例，女13 例，起病年龄1 d 至18 岁，29 例是在体检时发现FPG 升高就诊，3 例（病例11、病例15、病例27）因糖尿病家族史就诊，6 例（病例1-3，病例13，病例28、29）在3 个月以内起病。

所有病例均无高血糖症状，体格检查均无明显异常发现，无黑棘皮病，营养状况正常，糖尿病自身抗体均阴性，均未发生过酮症酸中毒。病例7在2 岁时出现癫痫，经左乙拉西坦治疗控制良好，其余情况良好。

1.2 临床资料收集（1）临床症状及体征；（2）实验室检查结果包括空腹血糖、糖化血红蛋白、胰岛素、C 肽、糖尿病自身抗体（谷氨酸脱羧酶抗体、抗蛋白酪氨酸磷酸酶抗体、抗胰岛素抗体、抗胰岛细胞抗体）；（3）治疗及随访情况：从发现血糖升高起每3～6 个月随访1 次。每次随访记录患儿自我末梢血糖监测水平，检测HbA1c。每1～2年禁食8 h后进行OGTT，口服葡萄糖剂量为1.75 g/kg（最大75 g）。对所有患儿的父母亲进行FPG 和HbA1c检测。

1.3 实验室检查（1）FPG 测定采用酶法测定；（2）HbA1c 采用乳胶免疫凝集抑制法测定（DCA 系统，西门子，德国埃朗根）；（3）胰岛素、C 肽采用化学发光免疫分析法测定（西门子，德国埃朗根）；（4）糖尿病自身抗体采用国际标准化放射配基受体结合法测定。

1.4 目的基因检测在患儿监护人签署知情同意书，并经我院医学伦理委员会讨论通过后（批准文号：2014-50），抽取患儿和父母外周抗凝血2 mL，采用美国QIAGEN 公司DNeasy Blood & Tissue Kit 试剂盒，提取全基因组DNA，设计引物扩增GCK 基因（NM_000162.2），引物序列见表1。扩增产物外送至华大基因公司进行Sanger 测序，测序结果与人类基因组变异数据库（HGMD）和ClinVar 数据库比对查新，确定变异。对于HGMD 未查找到的新发变异，利用SIFT、PolyPhen-2、Mutation Taster 和FATHMM 等在线工具预测致病性。对未找到GCK变异的患儿父母进行染色体微阵列分析及全外显子测序。从全血中提取全基因组DNA 后，外送基因公司，采用Illumina HiSeq X Ten 测序平台进行全外显子组测序，使用BWA 等生物信息软件对原始数据进行分析，评估测序质量并生成单核苷酸变异报告，与SNP 数据库、千人基因组数据库等进行比对，获得可疑的变异位点，根据遗传模式确定疾病基因和变异位点。

表1 GCK 基因的引物序列Tab.1 Primer for amplification of GCK gene coding sequences

2 结果

2.1 一般资料及临床表现32 例患儿FPG 轻度升高5.9～8.3 mmol/L，均值（6.7 ± 0.6）mmol/L，随访4～75 个月不等，血糖维持在（6.6 ± 0.69）mmol/L，不需要任何药物干预。起病年龄≤6 个月的6 例患儿HbA1c 3.0%～5.8%，6个月以上的患儿HbA1c 5.0%～7.0%，所有患儿HbA1c均值（5.90±0.96）%，其中10 例HbA1c ≥6.5%或OGTT 2 h 血糖≥11.1 mmol/L，为糖尿病患儿，19 例患儿提示糖耐量受损。在27 例进行了OGTT 试验的患儿中，25 例OGTT 2 小时血糖增幅＜3.5 mmol/L，2 例（病例14、病例15）增幅＞3.5 mmol/L，分别为5.9 mmol/L 及3.8 mmol/L。31 例患儿（病例11 失访）进行了4～75 个月随访，其中13 例患儿进行了OGTT 试验，12 例2 h 血糖增幅＜3.5 mmol/L，1 例（病例9）随访时出现2 h 血糖增幅＞3.5 mmol/L，为4.6 mmol/L。见表2。

表2 32 例MODY2 患儿的临床特征及随访Tab.2 Clinical features and Follow-up of 32 children with GCK-MODY

30 例携带GCK 基因变异的父母亲FPG 轻度升高，均值（6.60 ± 0.43）mmol/L，HbA1c 正常或轻度升高，均值（6.60±0.33）%。

2.2 GCK 基因检测结果32 例患儿共检测到GCK 基因30 个不同的杂合子变异，包括20 个错义变异，2 个剪接位点变异，1 个插入缺失变异，2 个无义变异及5 个移码变异，其中5 个为新发变异［4，8-14］（表3）。对32 例患儿的父母亲进行基因检测，其中30 例患儿父亲或母亲检测到与先证者相同的变异，7 例遗传自父亲，23 例遗传自母亲。有2 例患儿（病例23 及病例26）父母通过Sanger 测序、染色体微阵列分析及全外显子检测均未找到GCK 基因变异及其他单基因糖尿病的已知染色体微缺失或致病变异，在血糖正常的父亲或母亲中未发现GCK 基因变异。

表3 32 例MODY2 患儿的GCK 基因变异特征Tab.3 Characteristics of GCK gene variation in 32 patients with MODY2

3 讨论

GCK 是葡萄糖代谢中的关键酶，控制葡萄糖介导的胰岛素分泌。GCK 基因在常染色体显性遗传模式下，杂合失活变异可导致MODY2，在常染色体隐性遗传模式下，纯合或复合杂合失活变异可导致永久性的新生儿糖尿病［15］。国外文献报道GCK 因杂合失活变异是儿童无症状偶发性高血糖的常见病因［16-17］。本研究对中国32 例MODY2 患儿及其父亲/母亲进行临床特征分析及分子遗传学研究并随访，并对患儿的基因型-临床表型关系进行分析。MODY2 的典型特征是无症状的空腹高血糖，与常见的1 型或2 型糖尿病相比，MODY2并发症少，常不需要药物治疗，无酮症倾向，无胰岛β 细胞特异性自身抗体或胰岛素抵抗，目前确诊依靠基因分析。

既往认为MODY2 为青少年起病，但在本研究中，7 岁前起病的病例数占47%（15/32），其中6 例（19%）患儿3 个月以内起病。病例2 生后诊断为新生儿糖尿病，3 个月大时口服格列苯脲治疗，在1 岁4月龄时，行GCK 基因检测确诊MODY2，停用格列苯脲，停药后随访62 个月，患儿FPG 和HbA1c稳定在5.8～6.5 mmol/L和6.2%～6.7%。在2岁7月龄时OGTT 显示FPG 受损，但2 h 血糖水平正常。病例28、29 出现时，笔者已对MODY2 有所认识，因而在新生儿期即明确了诊断，避免了患儿进行不必要的治疗。病例29 生后因“宫内感染”转新生儿科住院，生后1 d 发现FPG 升高，住院期间监测FPG 波动于6.6～7.4 mmol/L，餐后2 h 血糖波动于6.7～8.8 mmol/L，为本组诊断年龄最小病例。6 例患儿随访5～75 个月不等，随访监测血糖稳定。本研究表明，MODY2 的空腹高血糖出生时即可存在，在婴幼儿期（包括新生儿期）出现持续的轻度高血糖要注意MODY2 的可能，这与RUDLAND［18］报道的相一致。

通常MODY2 患者FPG 在5.4～8.3 mmol/L 之间［19］，典型的≥40 岁MODY2 患者HbA1c 在5.9%～7.6%之间［20］。本组研究中患病的父亲/母亲FPG在5.9～7.8 mmol/L 之间，HbA1c 在5.9%～7.3%之间，未予药物治疗下未发现与糖尿病相关的并发症。OGTT 2 h 血糖增量＜3.5 mmol/L 是MODY2 与其他类型MODY 区别的特征之一［21］，但由于OGTT变异较大，当增量＞3.5 mmol/L 时也不能完全排除MODY2［22］。这一观点在本研究中也得到了验证，本组病例中除病例14、15 外，其余病例确诊时OGTT 2 h 血糖增高幅度均＜3.5 mmol/L，13 例随访时进行了OGTT试验，除病例9外增幅均＜3.5 mmol/L。

2 型糖尿病在中国的患病率很高，而且很多2 型糖尿病的儿童并不肥胖［23］，根据临床特征难以有效区分非肥胖的儿童2 型糖尿病前期阶段和MODY2，因此对该部分儿童进行GCK 基因分析非常必要。

HGMD 专业版数据库目前收录已报道GCK 基因变异976 种（http：//www.hgmd.cf.ac.uk），包含错义、无义、移码、插入缺失、重复和剪接位点变异。本研究中家族中所有发生了GCK 基因变异的父亲/母亲均有轻度糖尿病或血糖升高，而非糖尿病或血糖正常亲属中则没有检测到GCK 基因变异。GCK 基因变异广泛分布于9 个外显子（除1 号外显子外），未发现热点变异，变异类型以错义变异最常见（67%），其他变异类型包括剪接（7%）、插入缺失（3%）、无义（7%）和移码（16%），每种变异所导致的临床表型无明显差异，与STRIDE 等［21］报道一致。

本研究发现5种新发变异，c.934delG（p.E312Kfs*41）、c.197delC（p.Pro66Glnfs*21）、c.1175G＞T（p.Arg392Leu）、c.902T＞C（p.Leu301Pro）、c.1165G＞T（p.Val389Phe），通过在线生物信息学工具预测判定为致病性变异。c.934delG、c.197delC 两个移码变异使终止密码子提前，导致GCK 基因编码蛋白缩短，其缺失位点包括了GCK 与葡萄糖及ATP相结合的氨基酸位点。与c.1165G＞T 同一位点的c.1165G＞C（p.Val389Leu）变异为已知致病变异［24］，可导致酶活性及稳定性的降低。

目前诊断MODY2 的标准均包含家族史［7，25］，MODY2 自发变异概率很低，本组病例中发现两例自发变异病例（病例23、26），两例病例均是在体检中发现FPG 升高，在对其父母进行家系分析时，却未找到与先证者一致的变异位点，随后对患儿父母进行了染色体微阵列分析及全外显子检测，均未发现其他单基因糖尿病的已知染色体微缺失或致病变异，LOPEZ 等［26］也曾报道，在14 例GCK基因变异的MODY2 患者中发现2 例自发变异。因此对临床表现和实验室结果高度提示MODY2 的患者即使没有家族史，也应进行GCK 基因分析，否则将造成漏诊。

对于MODY2 患儿不需药物干预，药物治疗对降低血糖或HbA1c 无效，长期随访观察没有增加长期糖尿病相关的微血管和大血管并发症的风险［19］，对该部分患儿只需定期随访，但他们与普通人群一样，有患1 型和2 型糖尿病的风险，如果出现新的潜在临床特征，就需要进行重新评估和研究。基因确诊有助于预测临床病程和长期预后，制定合理的治疗方案。本组研究中有16 例患儿父亲/母亲发现血糖升高后曾使用不同的降糖药物治疗，经基因确诊MODY2 后，予停止了不必要的降糖药物治疗，随访过程中血糖维持稳定，既减少了治疗费用，也为患者及其家庭减轻负担及心理压力。

本组研究是目前中国关于MODY2 患儿样本量最大、随访时间最长的研究，拓展了中国人群MODY2 儿童患者的表型谱及GCK 基因变异谱。本研究发现中国MODY2 患儿临床特征与国外报道基本一致，进一步证实了MODY2 生后即可出现空腹血糖升高，对于无家族史但临床高度提示MODY2 的患儿也应进行GCK 基因分析。本文中没有将MODY2 患儿的临床特点与其他类型MODY 进行对比，未来将完善这项工作，并对自发变异的MODY2 患儿的致病机制及中国人群MODY2患儿的代谢特征进行进一步的研究。