非编码RNA调节糖尿病状态骨再生的研究进展

董骁懿 李昊

1广西医科大学口腔医学院口腔修复科（南宁 530021）；2广西口腔颌面修复与重建研究自治区级重点实验室（南宁 530021）

外伤、感染、肿瘤、骨骼系统异常等原因导致的骨缺损愈合不良严重影响患者的身心健康，骨再生医学致力解决这一问题，促进骨组织修复再生。骨再生是一个动态的过程，需要多种细胞和因子的参与。炎症细胞是骨缺损环境中的初始细胞成分，随后在骨愈合中发挥功能的是间充质干细胞、内皮细胞、软骨细胞、成骨细胞，最后破骨细胞进行骨重塑［1］。骨免疫与慢性炎症性疾病密切相关，免疫细胞如巨噬细胞和成骨相关细胞共用相同的微环境，相互作用、协同行使“骨免疫”的功能［2］。糖尿病（diabetes mellitus，DM）是由胰岛素分泌缺陷、胰岛素抵抗或两者共同引起的一组以高血糖为特征的慢性代谢性疾病。我国是糖尿病患病率增长最快的国家之一，目前我国成人糖尿病患病率达11.2%，约有糖尿病患者1.3 亿例［3-5］。糖尿病还会伴发相关骨疾病，如骨质疏松、骨折风险增加、骨延迟愈合等，严重影响患者的生存质量。这些可能与糖尿病状态下钙磷流失、维生素D 的缺乏、晚期糖基化终产物（advanced glycation end products，AGEs）的毒性、微血管功能受损和慢性炎症有关［6］。

ncRNAs（non-codingRNAs，ncRNAs）是从基因组转录而来，但不参与翻译蛋白质，大约有98%的RNA 无编码或者低编码能力。非编码RNA 按照其功能可分为管家非编码RNA 和调节非编码RNA。管家非编码RNA 是细胞生存必须的RNA，其含量相对恒定，主要包括参与蛋白质翻译的rRNAs、负责转运氨基酸的tRNAs、对RNA 前体进行加工的snRNAs 和加工细胞核中前体rRNAs 的snoRNAs。调节非编码RNA 主要包括小分子RNA（microRNAs，miRNAs）、长链非编码RNA（longnoncodingRNAs，lncRNAs）和环状RNA（circRNAs），参与细胞调控［7］、表观遗传［8］、骨再生［9］、肿瘤和糖代谢［10］等过程。内源竞争RNA（competing endogenous RNAs，ceRNAs）如circRNAs 和lncRNAs 可以作为miRNAs 海绵，通过竞争miRNAs 的结合位点从而抑制miRNAs 对其目标mRNAs 的调控。

近年来，ncRNAs 在骨再生等领域研究得到广泛重视，非编码RNA 在骨再生等疾病的研究主要是指miRNAs、lncRNAs 和circRNA 的作用。miRNAs 可以通过Wnt/β-catnein 信号通路、dkk3 基因的表达调节骨髓间充质成软骨和成骨分化［11-12］。最初关于miRNA 对骨生物学的影响是通过删除Dicer 酶可以观察到的，GRILLARI 等［13］认为，Dicer酶加工过的miRNA 在调控胎儿期和出生后的骨形成中起关键作用，miRNA 可以调节成骨细胞、骨髓间充质干细胞、巨噬细胞和破骨细胞的功能，同时与糖尿病状态下的骨质疏松密切相关。多种lncRNAs 作为潜在的生物标志物，可以调控成骨细胞的分化［14］有望成为骨代谢疾病的新型诊断和治疗方法。ANRIL 是一种lncRNA，KONG 等［15］发现，ANRIL 不仅与癌症密切相关，同时可能影响与2 型糖尿病、骨骼的大小、骨矿化程度以及骨密度密切相关。目前，随着相关研究的深入，越来越多研究表明ncRNAs 也可以调节糖尿病状态下骨缺损愈合，这为糖尿病状态骨缺损再生的诊断和治疗提供新的可能性。

1 microRNAs 调控糖尿病状态骨再生

microRNAs 是大小为19～25 个核苷酸的短核糖核酸分子，在调节目标基因的转录后沉默［16］。自1993年在秀丽隐杆线虫中发现miRNAs，越来越多研究表明miRNAs 是真核生物中调节生物过程的关键物质。miRNAs 几乎参与所有细胞的生物过程，与mRNAs 中互补序列结合后mRNAs 翻译被抑制或被降解［16］。miRNAs 数量多，单个miRNA 可调节数百个mRNAs，大约可以调控人类生物体中1/3的基因。近年来关于miRNAs 的基因治疗的研究发展迅速，目前大量miRNAs 模拟物和miRNAs 抑制剂处于研发阶段，这种治疗策略有望成为新的治疗药物在促进糖尿病骨再生中发挥巨大的潜力。

在糖尿病大鼠下颌骨中miR-221-3p 和miR-222-3p 的表达上调，通过IGF-1 调节ERK 的表达从而抑制骨髓间充质干细胞成骨分化，下调miR-221-3p 和miR-222-3p 的表达可能促进成骨［17］。当过度表达miR-449 时，通过Sirt1/Fra-1 信号通路抑制高糖和游离脂肪酸环境下骨髓充质干细胞的成骨分化［18］。本课题组研究发现，抑制miR-203-3p的表达，可以改善糖尿病小鼠种植区的骨形成，可能与调节Smad 信号通路及成骨相关因子表达有关［19］。在高糖条件下骨细胞携带含miR-124-3p 的细胞外囊泡，可以调节牙槽骨成骨细胞中Gal-3的表达［20］。JIANG 等［21］发现miR-26a 可以调节葡萄糖代谢，同时改善糖尿病小鼠胰岛素抵抗和糖耐量，改善骨微结构和质量，促进成骨细胞成骨和减少破骨细胞的分化。

胰岛β 细胞的主要功能是调节葡萄糖代谢，DUMORTIER 等［22］发现人和大鼠的胰岛细胞过度表达miR-375 会减弱胰岛β 细胞对血糖的调节作用，并且可能是糖尿病状态胰岛β 细胞特征消失的因素之一。同时HE 等［23］发现，大鼠产前咖啡因暴露可能通过miR-375/CTGF 通路导致H 型血管成管不良，进而相关长骨发育不良。间充质干细胞是哺乳动物中多向分化的细胞，可以分化为骨、软骨、神经、脂肪等细胞。有趣的是，同样有研究发现，将人脂肪间充质干细胞分泌的过度表达miR-375 的外泌体制成水凝胶载体，应用于大鼠颅骨缺损模型，影像学和组织学均显示骨再生能力增加，其机制可能为IGFBP3 通过与其3′UTR 结合而被抑制，从而改善骨髓间充质干细胞的成骨向分化［24］。这一截然不同的结果，可能是与miR-357 在不同组织与细胞中的显示出来功能的不同作用有关，也可能与不同表达剂量有关。miR-17-92在骨组织和成骨细胞中高表达，缺少miR-17-92 簇，引起成骨细胞增殖分化下调［25］；基因工程小鼠胰岛β细胞中miR-17-92缺失，糖耐量水平降低促进糖尿病的发展［26］。

QU 等［27］发现在体外模拟2 型糖尿病miR-155水平显著升高，miR-155 过表达可显著抑制碱性磷酸酶活性和Runx2 和OCN 的水平，将miR-155 和miR-155 抑制剂分别转染至人骨髓间充质干细胞中得出相反的结果。miR-155 不仅与糖尿病状态下骨髓间充质干细胞成骨分化相关，还参与巨噬细胞的极化。巨噬细胞是一类具有可塑性的先天免疫细胞，参与骨缺损愈合的全部阶段，影响骨再生。促炎破骨型M1 型巨噬细胞在清除坏死、凋亡细胞和入侵的病原体方面起着关键作用，抗炎成骨型M2 型巨噬细胞促进炎症消退、组织稳态平衡和损伤修复［28］。miRNAs 可以调节巨噬细胞的极化从而影响骨再生的过程。KANG 等［29］研究发现，在M1 极化的巨噬细胞细胞外囊泡中miR-155 的表达显著增加；M2 极化巨噬细胞胞外囊泡的miR-378a增加，提示抑制miR-155 的表达可能同时促进巨噬细胞向M2 型极化以及促进骨髓间充质干细胞成骨向分化。

2 lncRNAs 影响糖尿病状态下成骨

lncRNAs 是高度结构化的RNA 转录物，长度在200～1 000 个核苷酸之间。H19 是第一个被检测出来的lncRNA，最初将它归类于mRNAs，直到20世纪90年代发现XIST 之后lncRNAs 的功能才得到充分的阐述［30］。lncRNAs 可以折叠成具有非常复杂的二级和三级结构，有着与mRNAs 相同的降解过程［31］，lncRNAs 几乎存在于所有的细胞中。目前，研究发现lncRNAs 的作用机制主要为：作为信号传导因子参与信号传导、与转录因子结合形成复合物调节DNA 的表达、通过海绵miRNAs 调控mRNAs 的表达以及多种转录因子与lncRNAs 结合实现不同信号通路之间信息交汇调节正常与疾病状态下的生物过程［32］。随着lncRNAs 成为最新的研究热点，lncRNAs 在促进糖尿病状态骨再生有望成为新的潜力调控分子。

高糖可以抑制lncRNA AK028326 介导的CXCL13 的表达，抑制骨髓间充质干细胞的成骨分化，研究发现过表达AK028326 可以逆转高糖状态骨髓间充质干细胞成骨向分化被抑制的状态［33］。

YU 等［34］发现lncRNA-Dnm3os，可能通过神经生长因子调节小鼠ATDC5 细胞生长以及能够维持软骨细胞的增殖，并抑制软骨细胞的过早分化。同样ZHOU 等［35］研究表明Dnm3os 可以直接与miR-127-5p 结合，通过调节GREM2，蛋白多糖的沉积和软骨分化标记物的表达下降，大鼠骨髓间充质干细胞的软骨分化被抑制。但是，当lncRNA Dnm3os 表达增高进而与核仁蛋白相关的作用中断时，促进糖尿病状态下巨噬细胞的炎症反应［36］。综上所述，虽然有证据表明lncRNA-Dnm3os 可能促进骨骼发育，但是有可能加重糖尿病患者的炎症反应而带来负面作用。

ANRIL 是位于CDKN2A/B 基因座上的反义lncRNA 序列，CDKN2A/B 与人类癌症与代谢性疾病相关。ANRIL 可以抑制经LPS 诱导的HBMSCs 的成骨分化，HAMSCs 通过ANRIL/miR125a/APC/β-连环蛋白信号轴促进脂多糖诱导的HBMSCs 的成骨分化［37］。CURTIS 等［38］发现脐带CDKN2A 甲基化水平增加与儿童骨的大小、矿物质含量和密度的降低有关，同时CDKN2A/B 与2 型糖尿病和妊娠期糖尿病风险增高相关［39-40］，NAZARI 等［41］发现妊娠期糖尿病大鼠GDKN2A/B 低甲基化，子代CDKN2A/B mRNA 和蛋白质水平增高、胰腺β 细胞的功能损伤。ANRIL 是否可以通过调节CDKN2A/B 的表达改善糖尿病状态下骨再生水平仍需要实验对此进行研究。

3 cricRNAs 影响骨再生过程

随着高通量测序和生物信息学技术的发展大量的circRNAs 被发现，在哺乳动物细胞中的circRNAs 具有数量丰富、稳定性高、组织特异性和阶段特异性的特点，因为有稳定的环状结构而比线性RNA 稳定，可以防止核酸外切酶的降解。circRNAs 可以通过影响线性同源物的剪切、调节转录与剪切的过程、与蛋白质结合形成circRNPS 在疾病的发生和发展中发挥着重要的作用，某些病毒中circRNAs 同样可以翻译蛋白质［42］。近年来circRNAs 成为ncRNAs 研究的最新热点，但相关研究起步较晚、文章较少，而且目前尚未有关于circRNAs 在糖尿病状态骨缺损愈合中作用的研究报道。以下为数种已报道可以同时影响糖尿病和骨再生circRNAs，但是否可以在糖尿病状态下影响成骨，仍有待进一步研究。

p21 参与糖尿病的过程，可以改善糖尿病状态。有实验表明MPK38/MELK 通过对p21 的Thr55磷酸化，能够改善饮食诱导的肥胖小鼠的葡萄糖、脂质和能量代谢缺陷［43］。CircRNA 25487 通过海绵miR-134-3p 作用使p21 的表达下降、骨髓间充质干细胞和破骨细胞增殖被抑制，阻碍股骨头坏死的骨修复［44］。

CSF1 处理过的Csf1op/op 小鼠巨噬细胞密度显著高于未处理组Csf1op/op 小鼠，全身使用CSF1糖尿病Csf1op/op 小鼠的TNF、IL-6 等炎症因子表达增多［45］。circRNA 28313 和miR-195a、CSF1 形成ceRNAs 网络，下调circRNA 28313 的表达可以显著抑制RANKL + CSF1 诱导的单核巨噬细胞破骨分化，同时抑制去卵巢小鼠的骨吸收［46］。

4 展望

因全身性疾病、外伤、外科手术等原因造成的骨缺损，往往超出骨的正常自愈潜力，同时糖尿病及相关并发症严重阻碍骨组织再生。非编码RNA在真核生物的生理以及病理过程中发挥重要的调控作用，与骨缺损再生显示出了密切的相关性。多种ncRNAs 可以调节成骨，但ncRNAs 调控糖尿病状态骨再生的研究成果较少，其机制尚未被完全阐释。

miRNAs 作为最早被发现、研究成果最多的ncRNAs，可以直接与mRNAs 靶向结合调控基因的表达，在作为临床药物研发中具有较多的优势。近年来lncRNAs 与circRNAs日渐成为ncRNAs 研究的热点，因其特殊的结构不仅可以海绵miRNAs调控基因的表达，还可以通过调节组蛋白甲基化、调控靶蛋白的表达、调控转录、转录后调控等方式调节细胞和组织的功能和状态，这似乎预示着lncRNAs 和circRNAs 在疾病的发生和发展中发挥着更复杂的作用，目前关于此方面的研究仍处于较初步的研究，后续研究可以从此方面继续深入。CircRNAs 因其独特的环状结构可以逃避核酸外切酶的剪切作用，长期稳定的在血液、组织中存在，这也预示着circRNAs 成为疾病诊断的潜在biomarker 分子。因为ncRNAs 具有组织特异性、时空表达特异性的特点，在实验研究与临床试验中需要考虑其对不同组织的不同调控方向可能引起的副作用。研究ncRNAs 调控糖尿病状态骨再生，有望为糖尿病状态下骨缺损的诊断和靶点治疗提供新研究思路。