线粒体ND4基因12026 A→G突变与糖尿病视网膜病变视网膜中央动脉血流动力学变化的关系

王思琦 卢雪 金香子 于婕 金光明

延边大学附属医院超声医学科（吉林延吉 133000）

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）和糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）最常见的微血管并发症［1-2］。现阶段，从基因水平研究病因及预测风险因素是各国研究的热点，至今已有20 多种线粒体基因突变被发现与T2DM 有关［3-5］。有学者认为［6］同一疾病在不同民族之间，其易感基因也存在差异，朝鲜族作为我国代表性少数民族之一，研究其T2DM 及DR 的易感基因是非常有意义的。另据研究表明［7］，由炎症介质、神经递质引发的炎症及应激反应，可引起DR 患者视网膜中央动脉（central retinal artery，CRA）的血流动力学改变，这是导致DR 发生发展的重要原因。彩色多普勒超声（colour doppler ultrasound，CDUS）是临床上应用最为广泛的检查技术，在检测血流动力学指标方面，具有其他检查无可比拟的优势。本研究创新性地将基因突变与血流动力学改变相结合，旨在为延边朝鲜族T2DM 患者早期诊断DR 提供一些预警信息，以达到早期预防DR 发生的目标。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2020年1月至2021年8月在我院内分泌科及眼科住院的朝鲜族T2DM 患者198 例，其中男103 例，女95 例，平均年龄（53.87 ±15.30）岁。依据2014年中华医学会眼科学分会眼底病学组撰写的《我国糖尿病视网膜病变临床诊疗指南（2014年）》进行眼底病变分期。所有T2DM患者行眼底镜、裂隙灯检查并眼底照相。诊断出DR 患者67 例，无DR 患者131 例。应用PCR-RFLP技术检测患者线粒体ND4 基因12026 A→G 突变，根据结果分为无基因突变组和存在基因突变组，再以CDUS 对患者眼部进行检查，记录CRA 血流动力学指标。本研究伦理审核批准号为IACUC-201910010-81，实验前向所有患者详细告知实验内容，在患者自愿条件下签署知情同意书。

1.2 CRA 血流动力学检查方法应用SIEMENS S2000 彩色多普勒超声诊断仪，选用线阵探头（频率5～10 MHz），进行操作时，所有患者彩超诊断仪设定条件均一致。嘱患者取仰卧位，闭合眼睑，探头置于眼睑上方，当二维图像上出现眼球及视神经后，加用彩色多普勒超声，当清晰显示CRA 主干血流束时，将其放置于彩色取样框中央，再缓慢将取样线中心移至血流束颜色最明亮处，进行频谱多普勒测量，根据测量结果分别记录每位患者CRA 搏动指数（PI）、阻力指数（RI）最高流速（Vmax）、最低流速（Vmin）、平均流速（Vmean）和血流速度积分（VTI）等血流动力学参数。

1.3 DNA 提取和基因型检测

1.3.1 基因组DNA 提取空腹条件下，抽取患者静脉血3 mL，从中提取300 μL 移至1.5 mL 离心管中，按照DNA 基因组纯化试剂盒（赛默飞世尔科技）说明书上的步骤提取DNA，经紫外分光光度计定量，最后置于超低温冰箱储存。

1.3.2 聚合酶链反应根据基因库数据，上游引物：5′-TTTACCACAACACAATGGGG-3′，下游引物：5′-AAGGGGTCGTAAGCCTCTGT-3′，由赛默飞世尔科技公司合成。在离心管中依次加入5 μL 的10×PCR 缓冲液，5 μL 的dNTP（浓度为2.5 mmol/L），5 μL 的模板DNA，0.5 μL 的Taq DNA 聚合酶及上、下游引物各1 μL，其余部分添加无菌蒸馏水直至PCR 扩增反应体系达到50 μL。以赛默飞世尔热循环PCR 仪（Veriti 96）进行扩增，具体条件为：95 ℃预变性5 min；再按如下程序循环35 次：95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s；末次循环后，72 ℃延伸10 min。

1.3.3 限制性酶切离心管中分别加入PCR 扩增产物10 μL，0.5 μL Hinc Ⅱ内切酶（赛默飞世尔科技公司）进行酶切反应，结束后置于37 ℃水浴箱中孵育3 h。5%琼脂糖凝胶电泳，EB 染色后经紫外灯判断结果并拍照，判定所有样本基因型。

1.4 统计学方法用SPSS 23.0 软件包进行分析。计数资料以例数和百分数表示，比较用χ2检验，计量资料以（±s）表示，组间比较采用t检验或方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 线粒体基因ND4 12026（A→G）突变反向测序结果基因测序委托中科生信（北京信源佳生物科技有限公司）进行，实验根据“H-W 平衡定律”检验线粒体基因，结果显示基因型分布符合遗传平衡定律。进一步进行反向测序，结果显示线粒体基因12026 位点存在A→G 突变（图1）。

图1 线粒体基因ND4 12026（A→G）突变反向测序图Fig.1 Reverse sequencing of mitochondrial gene ND4 12026（A→G）mutation

2.2 线粒体基因ND4（12026）基因型判定经PCR 扩增后，线粒体ND4（12026）基因所得产物长度为209 bp，限制性内切酶HincⅡ酶切识别位点为GTY↓RAC（R=A 或G，Y=G 或T），线粒体DNA 12026 位点发生突变时将其分割成171 bp 和38 bp 两个片段（图2）。

图2 HincⅡ酶切线粒体基因ND4（12026）5%琼脂糖凝胶电泳图Fig.2 5%agarose gel electrophoresis of Hinc Ⅱenzyme digestion of mitochondrial gene ND4（12026）

2.3 无DR与DR患者线粒体ND4基因12026A→G突变情况在无DR 组131 例T2DM 患者中，检出线粒体DNA 12026 A→G 突变1 例，其突变率为0.08%；在DR 组67 例T2DM 患者中，检出线粒体DNA 12026 A→G突变10例，其突变率为14.91%，差异有统计学意义（χ2=3.522，P=0.023）。见表1。

2.4 无基因突变和有基因突变DR 患者CRA 血流动力学的比较有基因突变的DR 患者的CRA血流速度Vmax、Vmin、Vmean 及VTI 较无基因突变的DR 患者降低（P＜0.05），而PI、RI 增加（P＜0.001）。见表1、图3。

表1 无基因突变和有基因突变DR 患者之间CRA 血流动力学比较Tab.1 Comparison of CRA hemodynamics between DR patients without and with gene mutation ±s

表1 无基因突变和有基因突变DR 患者之间CRA 血流动力学比较Tab.1 Comparison of CRA hemodynamics between DR patients without and with gene mutation ±s

组别无突变组存在突变组P 值例数57 10 Vmax（cm/s）15.29±3.70 7.81±0.27 0.041 Vmin（cm/s）5.37±1.36 2.02±0.48 0.039 Vmean（cm/s）10.30±11.59 4.56±1.44 0.044 VTI 8.86±2.60 4.03±1.15 0.036 PI 0.51±0.52 0.87±0.24＜0.001 RI 0.53±0.03 0.82±0.18＜0.001

图3 无突变和存在突变的DR 患者CRA 血流动力学超声图Fig.3 Ultrasonography of CRA hemodynamics in DR patients without and with mutations

3 讨论

本研究中首先应用PCR-RFLP 技术和直接测序法检测了延边地区198 例朝鲜族T2DM 患者线粒体ND4 基因12026 A→G 突变的情况，根据结果将其分为无基因突变和有基因突变两组，再应用CDUS 对两组患者的CRA 血流动力学进行监测。发现DR患者突变率为14.9%，无DR患者突变率为0.08%，差异有统计学意义。

CRA 是负责滋养视网膜、维持视网膜血运的最主要动脉血管，一旦CRA 发生血管硬化、管腔狭窄、甚至闭塞时，则会导致视网膜毛细血管缺血缺氧，引发视网膜病变，甚至导致失明。研究显示，线粒体DNA 中的某些基因突变可以导致机体葡萄糖、胰岛素、脂质水平代谢异常，从而引起T2DM患者血管并发症的发生和发展［8-9］。此外，线粒体ND4 基因12026 A→G 的突变可导致T2DM 患者产生过多的活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS 引发CRA 硬化并最终形成DR 的可能机制如下：（1）使低密度脂蛋白被氧化，导致大量氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein cholesterol，ox-LDL）的形成，当其被巨噬细胞吞噬后，形成泡沫细胞堆积于血管壁，引发血管壁弹性下降［10］。（2）引发高级糖基化末端产物（advanced glycosylation end，AGE）的大量形成，通过激活多元醇、己糖胺和蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）等信号通路，使环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）在血管内皮过度表达，导致血管平滑肌的增殖迁移及血管内皮的缺血［11-13］。（3）与一氧化氮（nitric oxide，NO）协同作用产生大量过氧亚硝基阴离子（peroxynitroso anion，ONOO-），通过硝基化作用，导致血管壁纤维组织增生及钙质沉着，甚至斑块形成发生狭窄［14］。上述结果均会导致存在该基因突变的T2DM 患者CRA血管内阻力增大及血管弹性降低，因此在CDUS 检测时，呈现出CRA 血流速度明显降低，RI、PI 值升高的情况。

有不同学者［15-18］分别对我国云南、南昌和上海等地区汉族T2DM 患者线粒体基因mt12026 A→G 突变进行了研究，得出了该基因突变与汉族T2DM 患者的发病相关的结论，并且认为存在此基因突变的T2DM 患者起病更早，拥有明确的遗传史，在治疗上应尽早使用胰岛素治疗。而国内其他少数民族有关此类的研究则较稀少，根据本研究可得出初步结论，线粒体基因mt12026 A→G 突变是汉族与朝鲜族T2DM 患者发展为DR 的共同易感基因，这与一些国外学者的研究结果相类似［19-21］，但此基因突变是否是不同人种的普遍易感基因则需要结合不同人种做进一步的研究方可确定。

综上所述，存在线粒体ND4 基因12026A→G 突变的T2DM 患者，提示其发展为DR 的可能性升高，或可作为临床的一项预警信息。通过CDUS 观察评价T2DM 患者CRA 血流动力学变化，可作为预警DR的一项参考信息，具有一定的实用价值。