红景天苷改善慢性阻塞性肺疾病炎症模型及气道重塑的机制

黄莺 周芬 袁文胜 徐芳

1武汉市第一医院呼吸与危重症医学科（武汉 430022）；2泰康同济（武汉）医院呼吸与危重症医学科（武汉 430022）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是以气道炎症和气道重塑为主要病理特征的呼吸系统疾病，以抗炎、逆转气道重塑为主要治疗目标。红景天苷（Salidroside，SAL）为红景天主要有效成分，具有抗炎、抗氧化、抗衰老、抗恶病质、抗凋亡等特性［1］，LUO 等［2］报道红景天苷可通过抗炎作用缓解香烟烟雾引起的小鼠COPD 病情，但关于其在COPD 中的作用机制尚无定论。过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ）为核受体超家族成员之一，在肺部炎症控制中扮演了重要角色［3］。转化生长因子β（transforming growth factor β，TGF-β）为促纤维化细胞因子，在气道炎症与气道重塑中发挥了重要作用。研究表明，TGF-β1/果蝇母源抗生物皮肤生长因子（drosophilamothersagainstdecapentaplegic，Smad）通路是TGF-β1 诱导气道重塑的重要途径之一，其中Smad 蛋白是该途径调节系统的细胞内效应子，可介导细胞内信号传导，并促进靶基因转录［4］。为故本实验拟分析红景天苷治疗COPD 的功效，探索其通过PPAR-γ/TGF-β1/Smad2/3 通路影响COPD 相关炎症与重塑的潜在机制，为研发COPD治疗新药提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物SPF 级雄性SD 大鼠，40 只，7 周龄，体质量260～270 g，购自北京斯贝福生物技术有限公司，生产许可证号SCXK（京）2019-0010。实验开展前适应性饲养1 周，动物房温度22～26 ℃，相对湿度40%～60%，自然光照，普通饲料喂养，自由摄食饮水。

1.1.2 药物、主要试剂和仪器红旗渠香烟（焦油13 mg，尼古丁1.1 mg，河南安阳卷烟厂），布地奈德混悬液（AstraZeneca Pty Ltd，注册证号H20140475，规格2 mL：1 mg），红景天苷（北京索莱宝科技有限公司，HPLC ≥98%，分子式C14H20O7，分子量300.3，货号SS8080）。大鼠白介素-8（interleukin-8，IL-8）、IL-10 ELISA 试剂盒（南京森贝伽生物科技有限公司），PPAR-γ、磷酸化PPAR-γ（p-PPAR-γ）、TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3 和GAPDH 一抗（Abcam），辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 二抗（上海碧云天生物科技有限公司）。Buxcodx 动物肺功能分析系统PFT（美国BUXCO 公司），Smart view 凝胶图像分析系统（美国Major Science 公司）。

1.2 方法

1.2.1 造模、分组和干预将大鼠随机分为正常组、模型组、SAL 低剂量组、SAL 高剂量组和阳性对照组，每组8 只。除了正常组不作任何处理，其余四组用香烟烟熏法建立大鼠COPD 模型［5］：自制45 cm × 55 cm × 60 cm 烟熏箱，将大鼠置入箱内，每次点燃6 支香烟，每次烟熏10 min 左右，香烟燃尽5 min 后，打开顶盖让大鼠休息5 min，然后再次点燃6 支香烟重复上述步骤。每日烟熏1 次，每周6 次，共计36 周。连续烟熏7 d 后，第8 天开始烟熏前半小时予以腹腔注射给药，直至第36周最后1次烟熏结束。SAL 低、高剂量组每日上午烟熏前半小时分别腹腔注射红景天苷100、200 mg/kg［6］，模型组和正常组腹腔注射等体积生理盐水，阳性对照组予以雾化吸入布地奈德0.025 mg/kg，每日2次，该剂量参考《药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算》，动物与人每公斤体重剂量折算系数6.25，折算大鼠用药剂量为此剂量［7］。观察大鼠一般状况。

1.2.2 小动物肺功能检测仪检测各组大鼠肺功能最后1 次用药结束后，在大鼠器官软骨环之间取水平切口，置入金属插管固定，将大鼠置入体描箱，链接数据分析系统，检测呼吸功能参数用力肺活量（forced vital capacity，FVC）、第0.1 秒最大用力呼气容量（FEV0.1）、呼气峰流速（Peak Expiratory Flow，PEF），重复3 次检测，计算FEV0.1/FVC和PEF 值。

1.2.3 ELISA 法测定大鼠血清炎症因子腹主动脉采血，离心取血清，参考大鼠血清IL-8、IL-10 ELISA 试剂盒检测。

1.2.4 HE 染色观察大鼠肺组织病理变化处死大鼠，取右肺中叶，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋后制作3 μm 厚左右的连续切片。取一半切片根据HE 染色试剂盒染色，脱水，透明，封片，镜下计数炎性细胞，随机选取10 个视野计数，用半定量法进行评分：（1）无肺泡炎（-）；（2）轻度肺泡炎（+），细胞浸润致肺泡隔增宽，病变范围不足全肺20%；（3）中度肺泡炎（++），病变范围占全肺20%～50%；（4）重度肺泡炎（+++），病变弥漫性分布，范围超过50%。根据分级依次计1、2、3、4 分。

1.2.5 Masson染色观察气道平滑肌与胶原面积取剩余切片脱蜡至水，置入Masson复合染色液10 min，清洗，置入5%磷钨酸1 min，清洗，置入亮绿染色液，脱水、透明、封片。用Img-Pro 6.0 图像分析系统，确定5 个完整的支气管横截面，测定支气管基底膜内壁周径（Pbm）、胶原沉积面积（Wcol）和平滑肌面积（WAm）。

1.2.6 Western blot 检测肺组织中PPAR-γ/TGFβ1/Smad2/3 通路蛋白表达取左肺组织研磨，裂解后提取蛋白液，BCA 法进行蛋白质定量，电泳后转膜、封闭。与兔抗大鼠PPAR-γ、p-PPAR-γ、TGFβ1、Smad2/3、p-Smad2/3 和GAPDH 一抗（1∶1 000）孵育过夜后，加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 二抗（1∶2 000）室温孵育2 h。经发光、显影和定影后，分析目的蛋白与内参蛋白灰度值比值。

1.3 统计学方法采用SPSS 26.0 统计软件分析本次实验数据，计量资料以均数±标准差表示，多组进行单因素方差分析，进一步两两比较进行LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般状况造模开始后，大鼠有明显的气促、烦躁和站立不稳等症状，且随着造模时间延长，上述表现越来越明显，同时出现反应迟钝、毛色晦暗以及体重减轻等情况，表示造模成功。与模型组比较，干预组用药后上述表现有所好转，且有时间依赖性。正常组大鼠外观、活动、精神以及呼吸等均正常。

2.2 大鼠肺功能指标与正常组比较，模型组大鼠FEV0.1/FVC 和PEF 值降低（P＜0.05）；与模型组比较，SAL 低、高剂量组和阳性对照组大鼠FEV0.1/FVC 和PEF 值升高，其中SAL 低剂量组＜SAL 高剂量组＜阳性对照组（P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠肺功能指标Tab.1 Pulmonary function indexes of rats in each group x±s

2.3 大鼠血清炎症因子与正常组比较，模型组大鼠血清IL-8 水平较高，IL-10 水平较低（P＜0.05）；与模型组比较，SAL 低、高剂量组和阳性对照组大鼠血清IL-8 水平较低，IL-10 水平较高（P＜0.05）；与SAL 低剂量组比较，SAL 高剂量组和阳性对照组大鼠血清IL-8 水平较低，IL-10 水平较高（P＜0.05）；与SAL 高剂量组比较，阳性对照组大鼠血清IL-8 水平较低，IL-10 水平较高（P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠血清炎症因子Tab.2 Serum inflammatory factors of rats in each group x±s，pg/mL

2.4 大鼠肺组织病理改变HE 染色（图1）显示：与正常组比较，模型组支气管壁、间隔和血管周围有大量炎性细胞浸润；与模型组比较，SAL 低剂量组有所改善，SAL 高剂量组进一步改善，阳性对照组显著改善。肺泡炎症半定量评分：对照组＜阳性对照组＜SAL 高剂量组＜SAL 低剂量组＜模型组（P＜0.05），见表3。

图1 肺组织病理学（HE 染色，×200，标尺50 μm）Fig.1 Lung histopathology（HE staining，×200，scale bar 50 μm）

表3 大鼠肺泡炎症程度半定量评分Tab.3 Semi-quantitative score of the degree of alveolar inflammation in rats ±s，分

表3 大鼠肺泡炎症程度半定量评分Tab.3 Semi-quantitative score of the degree of alveolar inflammation in rats ±s，分

组别正常组模型组SAL 低剂量组SAL 高剂量组阳性对照组例数8 8 8 8 8肺泡炎症评分0.12±0.02 3.66±0.18*2.96±0.14*#1.72±0.12*#&0.78±0.08*#&△

2.5 大鼠气道病理改变Masson 染色（图2）显示：支气管壁平滑肌细胞呈红色，胶原纤维呈蓝色，与正常组比较，模型组大鼠平滑肌明显增生、肥大，气道胶原沉积明显增多。与模型组比较，SAL 低剂量组气道上述病理表现减轻，AL 高剂量组进一步减轻，阳性对照组显著减轻。大鼠气道WAm/Pbm、Wcol/Pbm 值：对照组＜阳性对照组＜SAL高剂量组＜SAL低剂量组＜模型组（P＜0.05），见表4。

表4 大鼠气道病理表现Tab.4 Pathological manifestations of rat airway x±s，μm2/μm

图2 大鼠肺部病理图（Masson 染色，×200，标尺100 μm）Fig.2 Pathological map of rat lungs（Masson staining，×200，scale bar 100 μm）

2.6 大鼠肺组织中PPAR-γ/TGF-β1/Smad2/3 通路蛋白表达各组PPAR-γ 和Smad2/3 蛋白表达比较差异无统计学意义（P＞0.05）。与正常组比较，模型组大鼠肺组织中p-PPAR-γ 蛋白表达水平较高，TGF-β1、p-Smad2/3 蛋白表达水平较低（P＜0.05）；与模型组比较，SAL 低、高剂量组大鼠肺组织中p-PPAR-γ 蛋白表达水平较低，TGF-β1、p-Smad2/3 蛋白表达水平较高（P＜0.05）；与SAL 低剂量组比较，SAL 高剂量组大鼠肺组织中p-PPAR-γ 蛋白表达水平较低，TGF-β1、p-Smad2/3 蛋白表达水平较高（P＜0.05），见表5、图3-4。

图3 大鼠肺组织中PPAR-γ/TGF-β1/Smad2/Samd3 通路蛋白条带图Fig.3 PPAR-γ/TGF-β1/Smad2/Samd3 pathway protein bands in rat lung tissue

表5 大鼠肺组织中PPAR-γ/TGF-β1/Smad2/3 通路蛋白表达Tab.5 PPAR-γ/TGF-β1/Smad2/3 pathway protein expression in rat lung tissue ±s

表5 大鼠肺组织中PPAR-γ/TGF-β1/Smad2/3 通路蛋白表达Tab.5 PPAR-γ/TGF-β1/Smad2/3 pathway protein expression in rat lung tissue ±s

组别正常组模型组SAL 低剂量组SAL 高剂量组p-PPAR-γ 0.25±0.03 0.97±0.06*0.69±0.05*#0.41±0.03*#&PPAR-γ 0.98±0.07 0.99±0.06 0.98±0.08 0.97±0.09 TGF-β1 0.46±0.04 0.09±0.01*0.22±0.02*#0.34±0.03*#&p-Smad2/3 0.75±0.06 0.22±0.03*0.43±0.04*#0.60±0.05*#&Smad2/3 0.95±0.06 0.94±0.07 0.93±0.08 0.96±0.08

3 讨论

COPD 的发生机制尚未明确，西医常用布地奈德等吸入糖皮质激素治疗，但部分患者对其敏感性降低，甚至出现抵抗。中医药在COPD 治疗中有着众多方法和独特优势，其中红景天性寒、味甘而涩，归肺经，有补肺气、散瘀活血之功效，常用于COPD 治疗中。红景天苷是从红景天中提取的一种化合物，有许多有益的病理功效，HU 等［8］报道红景天苷有抗炎功效，ZHANG 等［9］证明红景天苷可治疗肺损伤，故将其作为实验药物，并尝试分析其作用机制。

图4 大鼠肺组织中PPAR-γ/TGF-β1/Smad2/Samd3 通路蛋白表达水平Fig.4 Expression levels of PPAR-γ/TGF-β1/Smad2/Samd3 pathway proteins in rat lung tissue

COPD 是以气流受限为特征，伴发肺对有毒气体或颗粒异常炎症反应的呼吸病，其发生与吸烟密不可分。故本实验以香烟烟熏造模，发现大鼠出现呼吸急促、口唇发绀等COPD 症状，且病理切片可见肺组织出现炎性细胞浸润，平滑肌增厚，气道胶原沉积，符合COPD 与气道重塑的病理变化，说明造模成功。FEV0.1/FVC 和PEF 是临床评估肺功能的常用指标，其中FEV0.1/FVC 反应个体通气功能，PEF 则可判断气道是否堵塞，本研究结果显示：红景天苷干预后大鼠FEV0.1/FVC 和PEF 值升高，提示红景天苷可改善COPD 大鼠肺功能。气道炎症和气道重塑几乎同步，HE 染色观察发现，与模型组比较，SAL 低、高剂量组大鼠肺组织炎症浸润明显减轻，炎症评分降低，提示红景天苷对COPD有抗炎功效。IL-8 为介导肺部炎症反应的重要介质，是T 淋巴细胞和中性粒细胞强趋化因子，能够募集大量T 淋巴细胞与中性粒细胞持续聚集在肺部。烟熏可刺激中性粒细胞、巨噬细胞等分泌大量IL-8，诱导上述炎症细胞聚集在肺部，形成恶性循环［10］。IL-8 还可促进中性粒细胞释放弹性蛋白酶，破坏弹性纤维，刺激尿液分泌，增加基底膜，引起支气管痉挛，刺激内皮细胞分泌IL-8，最终形成链式反应，加重肺部炎症反应。IL-10 是活化的T 细胞与单核细胞所分泌，可抑制内皮细胞和单核细胞等分泌促炎因子，比如缩短烟熏诱发的肺内炎症细胞增加过程，抑制促炎因子肿瘤坏死因子α、IL-6 等表达，减轻肺部炎症反应，是肺部炎症一个重要内源性抑制剂［11］。本研究显示：红景天苷干预后大鼠血清IL-8 水平较低、IL-10 较高，肺组织浸润减少，肺泡炎症评分较低，提示红景天苷可抑制IL-8 分泌同时提升IL-10 浓度，红景天苷对COPD 有抑炎作用。Masson 染色显示：红景天苷干预后大鼠平滑肌增生和气道胶原沉积均明显减少，WAm/Pbm 和Wcol/Pbm 值降低，提示红景天苷可对COPD 大鼠气道重塑有改善作用，这对减轻COPD气促等症状及抑制COPD进展有重大作用。

PPARs 是核激素受体超家族成员，也是依赖配体活化的一类转录因子，可通过反式阻抑机制抑制细胞促炎作用，PPAR-γ作为其亚型之一，本身及其配体因抗炎作用显著而备受关注［12-13］。TAM 等［14］通过建立体外肺泡巨噬细胞模型和与COPD相关的体内动物模型，发现了PPAR-γ的抗炎潜力，证明其相关激动剂对烟草引起的肺部炎症有治疗作用。本研究中，红景天苷干预后大鼠肺组织中p-PPAR-γ蛋白表达水平升高，提示红景天苷可上调COPD 大鼠肺部PPAR-γ 蛋白表达，这可能是红景天苷发挥抗炎作用的靶蛋白。TGF-β超家族在细胞外基质重塑方面有重要作用，其中TGF-β1 是一种重要的促纤维化因子和炎症介质，可促进胶原蛋白聚集在细胞外基质内，导致气道重塑［15-16］。Smads 蛋白家族是迄今唯一被证明的TGF-β受体作用底物，也是TGF-β1受体复合物下游信号调节蛋白，其中Smad3为受体调节型Smad 蛋白，与Smad2 一起被TGF-β1Ⅳ型受体激活后，与Smad4组成异源性多聚体，转入细胞核，激活DNA 转录，调节靶蛋白表达。DENG等［17］、SUN 等［18］证明Smad2 过表达时会增加气道胶原蛋白沉积，促进平滑肌增生，导致气道平滑肌增厚，推测Smad2与气道重塑有关。本实验中，模型组肺部TGF-β1、p-Smad2/3蛋白表达水平高于正常组，提示烟熏造模激活了TGF-β1/Smad 信号通路；红景天苷干预后大鼠肺部TGF-β1、p-Smad2/3 蛋白表达水平降低，提示红景天苷可抑制TGF-β1/Smad 信号通路，这可能是其抑制肺纤维化、肺部炎症以及气道重塑的机制之一。

总之，红景天苷对COPD 大鼠有抗炎和改善气道重塑的作用，可能通过调节PPAR-γ/TGF-β1/Smad信号通路实现的。但本研究亦存在一些不足，比如红景天苷是否能靶向PPAR-γ、PPAR-γ 是否为红景天苷唯一靶点等，这将在未来进一步研究。