葛根素调控miR-30e-5p缓解高糖所致的足细胞损伤*

梅兰，郭阳，张宁，傅盼盼，孙国钧

1.北部战区总医院和平院区，辽宁 沈阳 110000； 2.大连市友谊医院，辽宁 大连 116000

糖尿病肾病是糖尿病常见并发症之一，其发病率逐年上升，已严重影响患者生活质量，随着疾病进展糖尿病肾病最终发展为终末期肾病。然而，糖尿病肾病的发病机制尚未完全阐明。研究发现，足细胞损伤可引起糖尿病肾病的发生，而足细胞凋亡、内质网应激等均可诱导足细胞损伤[1]。目前，临床尚缺乏防治足细胞损伤的方法，既往研究显示，中医药在抗氧化、抗炎及肾脏保护方面具有独特的优势[2-3]。葛根素为中药葛根的主要成分，具有降血糖等作用，还可通过调控尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(recombinant nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4，NOX4)的表达抑制糖尿病肾病的发展进程[4]，但关于葛根素治疗糖尿病肾病的分子机制尚未完全阐明。微小RNA(miRNA，miR)在糖尿病肾病发病机制中发挥重要调控作用，其可通过调控靶mRNA的表达参与足细胞损伤过程[5]。研究表明，miR-30e-5p在糖尿病肾病患者中表达水平降低，并可能参与糖尿病肾病的发生过程[6]。基于此，本研究采用高糖诱导小鼠肾足细胞MPC5建立足细胞损伤模型，探讨葛根素能否通过调控miR-30e-5p的表达抑制高糖诱导的足细胞损伤，并初步探究其可能的作用机制。

1 材料

1.1 细胞小鼠肾足细胞MPC5购自上海联迈生物工程有限公司(货号：LHY2125)。

1.2 药物与试剂葛根素(纯度≥98%，美国Sigma公司，批号：20190203)；葡萄糖(北京酷来搏科技有限公司，批号：20190105)；Lipofectamine2000(南京信帆生物技术有限公司，批号：20190106)；Trizol试剂(北京全式金生物技术有限公司，批号：20190207)；miRcute 增强型miRNA cDNA 第一链合成试剂盒、Quant one step RT-qPCR 试剂盒(SYBR Green)(北京天根生化科技有限公司，批号：20190211、20181223)；细胞凋亡检测试剂盒(北京博迈斯科技发展有限公司，批号：20181215)；兔抗鼠半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶3(cysteinyl aspartate-specific protease-3，caspase-3)抗体、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)抗体、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)抗体(美国Santa Cruz公司，批号：20190108、20190122、20190116)；兔抗鼠p62抗体、微管相关蛋白轻链3Ⅱ(microtubule-associated protein l light chain 3，LC3-Ⅱ)抗体、LC3-Ⅰ抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体(美国CST公司，批号：20190124、20190201、2019021、120190119)；HRP标记的山羊抗兔IgG二抗(美国Abcam公司，批号：20190203)；miR-30e-5p寡核苷酸模拟物(miR-30e-5pmimics)及阴性对照序列(miR-NC)、miR-30e-5p特异性寡核苷酸抑制剂(anti-miR-30e-5p)及其阴性对照(anti-miR-NC)(广州锐博生物科技有限公司，批号：20190132、20190136、20190096、20190138)；miR-30e-5p引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。

1.3 仪器FACS Calibur型流式细胞仪(美国贝克曼库尔特有限公司)；7500型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；DYY-7C型电泳仪电源、DYCZ-24DN型垂直电泳槽、DYY-12型电泳仪(北京六一仪器厂)；JY02S型紫外分析仪、JY-SPCT型水平电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司)；Nano-100型微量分光光度计(杭州奥盛仪器有限公司)；mμlISKANMK3型酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；HI650型离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)。

2 方法

2.1 分组与干预MPC5细胞常规培养，调整细胞密度为3×105mL-1，接种于96孔板，每孔 100 μL，分为对照组、模型组、低剂量葛根素组、中剂量葛根素组及高剂量葛根素组。对照组加入含有浓度为5.5 mmol·L-1葡萄糖的培养液，模型组加入含有浓度为30 mmol·L-1葡萄糖的培养液[7]，低、中、高剂量葛根素组分别加入含有30 mmol·L-1葡萄糖及不同剂量(1 μmol·L-1、5 μmol·L-1、10 μmol·L-1)葛根素[8]的培养液，培养24 h后进行指标检测。miR-NC、miR-30e-5pmimics转染至MPC5细胞后，加入含有浓度为30 mmol·L-1葡萄糖的培养液培养24 h，分别记作miR-NC组、miR-30e-5p组。anti-miR-NC、anti-miR-30e-5p转染至MPC5细胞，分别加入含有10 μmol·L-1葛根素与30 mmol·L-1葡萄糖的培养液培养24 h，分别记作高剂量葛根素+anti-miR-NC组、高剂量葛根素+anti-miR-30e-5p组。

2.2 流式细胞术检测细胞凋亡率取各组MPC5细胞加入预冷PBS洗涤，弃上清，加入500 μL缓冲液重悬细胞，参照细胞凋亡检测试剂盒说明书分别加入Annexin V-FITC与PI，应用FACS Calibur流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

2.3 RT-qPCR检测MPC5细胞中miR-30e-5p的表达水平采用Trizol法提取各组MPC5细胞中的总RNA，反转录成cDNA，反转录体系：5×gDNA Buffer 2 μL，10×King RT Buffer 2 μL，FastKing RT Enzyme Mix 1 μL，FQ-RT Primer Mix 2 μL，RNA 2 μg，RNase-Free ddH2O补足体系至20 μL；反应条件：42 ℃ 15 min，95 ℃ 3 min。RT-qPCR扩增，反应体系：10×PCR Buffer 2.5 μL，MgSO42.5 μL，dNTPs 2.5 μL，正反向引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，RNase-Free ddH2O补足体系至25 μL，应用荧光定量PCR仪检测miR-30e-5p相对表达量。miR-30e-5p正向引物序列：5′-GGGTGTAAACATCCTTGAC-3′，反向引物序列：5′-TGCGTGTCGTGGAGTC-3′；U6正向引物序列：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

2.4 Western Blot检测caspase-3、Bax、Bcl-2、p62、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ的蛋白表达量提取各组MPC5细胞总蛋白进行定量，蛋白变性后进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，转移至聚偏氟乙烯(vinylidene fluoride，PVDF)膜，使用5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗孵育(稀释11 000)24 h，孵育二抗(稀释比例13 000) 1 h，暗室内曝光显影，应用ImageJ软件分析各条带灰度值，并计算LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值。

3 结果

3.1 葛根素对高糖诱导的MPC5细胞凋亡的影响与对照组比较，模型组细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，caspase-3、Bax蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；与模型组比较，中剂量葛根素组、高剂量葛根素组细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，caspase-3、Bax蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达水平显著升高(P<0.05)；与中剂量葛根素组比较，高剂量葛根素组细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，caspase-3、Bax蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。见表1，图1。

表1 葛根素对高糖诱导的MPC5细胞凋亡的影响

注：A：细胞凋亡流式图；B：凋亡相关蛋白表达图图1 葛根素对高糖诱导的MPC5细胞凋亡的影响

3.2 葛根素对高糖诱导的MPC5细胞自噬的影响与对照组比较，模型组p62蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著降低(P<0.05)；与模型组比较，中剂量葛根素组、高剂量葛根素组p62蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著升高(P<0.05)；与中剂量葛根素组比较，高剂量葛根素组p62蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著升高(P<0.05)。见图2，表2。

图2 葛根素对高糖诱导的MPC5细胞自噬的影响

3.3 葛根素对高糖诱导的MPC5细胞中miR-30e-5p表达的影响与对照组比较，模型组miR-30e-5p的表达水平显著降低(P<0.05)；与模型组比较，中剂量葛根素组、高剂量葛根素组miR-30e-5p的表达水平显著升高(P<0.05)；与中剂量葛根素组比较，高剂量葛根素组miR-30e-5p的表达水平显著升高(P<0.05)。见表3。

表2 葛根素对高糖诱导的MPC5细胞自噬的影响

表3 葛根素对高糖诱导的MPC5细胞中miR-30e-5p表达的影响

3.4 过表达miR-30e-5p对高糖诱导的MPC5细胞凋亡及自噬的影响与miR-NC组比较，miR-30e-5p组细胞凋亡率及caspase-3、Bax、p62蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著升高(P<0.05)。见图3，表4。

注：A：细胞凋亡流式图；B：凋亡及自噬相关蛋白表达图图3 过表达miR-30e-5p对高糖诱导的MPC5细胞凋亡及自噬的影响

表4 过表达miR-30e-5p对高糖诱导的MPC5细胞凋亡及自噬的影响

3.5 干扰miR-30e-5p的表达能逆转葛根素对高糖诱导的MPC5细胞凋亡及自噬的影响与高剂量葛根素+anti-miR-NC组比较，高剂量葛根素+anti-miR-30e-5p组细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，caspase-3、Bax、p62蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著降低(P<0.05)。见图4、表5。

注：A：细胞凋亡流式图；B：凋亡及自噬相关蛋白表达图图4 干扰miR-30e-5p能逆转葛根素对高糖诱导的MPC5细胞凋亡及自噬的影响

表5 干扰miR-30e-5p能逆转葛根素对高糖诱导的MPC5细胞凋亡及自噬的影响

4 讨论

糖尿病肾病是引发终末期肾病的重要原因之一，目前临床尚缺乏防治糖尿病肾病进展的有效措施[9-11]。近年来的研究发现，中医药可通过减轻足细胞损伤对糖尿病肾病的防治发挥作用[12-16]，也可通过调控多种基因或信号通路表达减缓糖尿病肾病的发展进程[17-20]。因而，积极探寻新型糖尿病肾病的治疗药物并探究其可能作用机制，成为防治糖尿病肾病的新方向。

葛根素是葛根的主要成分，具有改善心脑血管循环、抑制心肌细胞凋亡等作用，可通过抑制核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信号通路抑制缺血再灌注所致的心肌细胞凋亡[21]，还可通过抑制线粒体解偶联蛋白2(uncoupling protein 2，UCP2)的表达保护2型糖尿病大鼠胰腺β细胞[22]，通过上调miR-155-3p的表达抑制髓样分化因子(myeloiddifferentiationfactor88，MyD88)的表达从而减轻血管内皮小细胞损伤[23]。本研究结果显示，高糖处理后，足细胞凋亡率明显提高，与相关文献报道结果一致[24]，提示高糖诱导可成功建立足细胞损伤模型。使用不同剂量的葛根素处理后，高糖诱导的足细胞凋亡率明显降低，caspase-3、Bax蛋白表达水平显著降低，Bcl-2蛋白表达水平显著升高，且呈剂量依赖性，提示葛根素可抑制高糖诱导的足细胞凋亡从而减轻细胞损伤。自噬与细胞凋亡密切相关，自噬的主要过程为细胞将自身胞质内蛋白或细胞器包被后与溶酶体形成自噬小体进而降解细胞，自噬发生时LC3-Ⅰ转变为LC3-Ⅱ，p62与LC3偶联从而参与自噬过程[25]。本研究结果显示，高糖处理足细胞后可明显提高p62蛋白表达水平，降低LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，而葛根素可明显降低p62的表达水平，提高 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，且呈剂量依赖性，提示葛根素可能通过诱导细胞自噬而调控细胞凋亡。

研究表明，miR-30e-5p可减轻缺氧诱导的心肌细胞凋亡[26]。miR-30e-5p通过调控去整合素-金属蛋白酶9(disintegrin-metalloproteinase 9，ADAM9)抑制血管紧张素II诱导的心肌细胞肥大[27]。本研究发现，高糖诱导的足细胞中miR-30e-5p的表达水平降低，而葛根素可明显提高miR-30e-5p的表达水平，提示葛根素可能通过促进miR-30e-5p的表达减轻高糖诱导的足细胞损伤。本研究进一步分析显示，miR-30e-5p过表达可明显降低高糖诱导的足细胞凋亡率，抑制caspase-3、Bax、p62的表达，促进Bcl-2的表达，并可提高LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，提示miR-30e-5p过表达可抑制高糖诱导的足细胞凋亡从而减轻足细胞损伤。

综上所述，葛根素可通过上调miR-30e-5p的表达抑制高糖诱导的足细胞凋亡从而减轻细胞损伤，其作用机制可能与诱导细胞自噬有关，为进一步揭示葛根素治疗糖尿病肾病的分子机制奠定实验基础。