好氧堆肥对抗生素抗性基因的消长影响研究进展

钟为章，陈赛男，李月，潘子欣，洪晨，秦学，李再兴

(1.河北科技大学 环境科学与工程学院，河北省污染防治生物技术实验室，河北 石家庄 050018； 2.北京科技大学 能源与环境工程学院，北京市工业典型污染物资源化处理重点实验室，北京 100083)

我国是抗生素生产大国，每年因生产抗生素而产生的菌渣量达到13万t以上[1]。抗生素被大量滥用于畜牧养殖业，残留的抗生素会产生大量抗生素抗性基因(ARGs)，这些ARGs在环境中的日益出现和传播对临床感染治疗和人类健康构成了重大威胁。这些ARGs可能通过传播到生长在施肥土壤中的植物而迁移到食物链中或者可以通过由移动遗传元件(如整合子、转座子或质粒)介导的水平基因转移(HGT)传播到更广泛的土壤细菌群落中。施用粪肥或者抗生素菌渣填埋会促进细菌宿主生长，从而导致土壤中残留ARGs含量的增加。由于大量的抗生素菌渣填埋导致在农业生态系统中出现的ARGs引起了全球关注，人们逐渐意识到ARGs在环境中的持久性残留、传播和扩散的危害比抗生素本身还要大，因此迫切需要开发有效的工艺措施来减轻ARGs在环境中的传播已成为当今急需解决的难题。目前处理抗生素抗性菌(ARB)和ARGs的方法及优缺点分析见表1。

表1 ARB和ARGs处理技术优缺点对比Table 1 Comparison of advantages and disadvantages of ARB and ARGs processing technology

这些工艺不仅能高效去除ARB和ARGs，而且能有效控制ARGs的传播[6]。综合比较发现，大多数病原生物和含ARGs的细菌在高温堆肥过程中被自热高温迅速杀死，降低选择压力，改变微生物的群落结构进而使ARGs减少；好氧堆肥能有效降低畜禽粪便、抗生素菌渣等较高抗生素浓度的固体废弃物中ARGs的多样性和丰度，降低其在可耕地土壤中传播的潜在风险，故好氧堆肥被认为是处理ARGs最有前途的方法之一。此外，好氧堆肥是处理富含ARGs的固体废物用来生产高质量和稳定的土壤改良剂的有效方法，可以提高作物生产土壤的肥力，有利于实现其减量化、资源化和无害化。

本文从好氧堆肥对ARGs的消长影响的角度进行研究，分别从外源添加物如辅料、氯化铁、零价纳米铁及生物菌剂等对ARGs消长影响的强化研究；并探讨了好氧堆肥体系内重金属和细菌群落对ARGs消长影响的主要因素。

1 外源添加物强化对ARGs消长的研究现状

传统、单一的好氧堆肥技术(图1)已发展的较为成熟[1-2，7]，但易造成堆体营养成分损失、环境污染及对ARGs去除效率不理想且使部分基因富集。因此，目前大多数关于好氧堆肥过程中抗生素和ARGs处理的研究都是在外源添加物的条件下进行的。一般外源添加物主要分为辅料如木屑、秸秆、蘑菇渣、生物炭、氯化铁、天然沸石等和生物菌剂如极端嗜热微生物菌剂、抗生素降解菌等。

图1 好氧发酵工艺流程图Fig.1 Aerobic fermentation process route

1.1 辅料

在用畜禽粪肥堆肥过程中，通常都会添加辅料，因为它可以调节湿度和粪肥的碳氮比，使其达到最佳的堆肥条件，使堆肥温度迅速升高[8]，提高好氧堆肥效率。通常添加的辅料一般有膨松剂、零件纳米铁、氯化铁和生物菌剂等。

1.1.1 膨松剂 堆肥温度的升高或高温保留通常被认为是膨松剂(如稻草、生物炭、赤泥等)有利于抗生素降解[9]和去除ARGs的关键原因[10]；由于大多数抗生素在嗜热条件下是不稳定的，故需要添加膨松剂，且膨松剂的材料多种多样，加入后能够促进堆肥腐熟进程，缩短堆肥周期，改善堆肥品质，减少有害气体排放等，故最常用。

Qiu等[9]研究表明在堆肥中添加稻草和锯末可以增加对堆肥后磺胺类抗生素残留物的去除，可以增强抗生素的降解，抑制ARGs在粪肥中的扩散。Zhang等[11]比较了木屑、稻壳和蘑菇渣的三种原料和猪粪和鸡粪进行堆肥，堆肥剂的添加提高了猪粪中抗生素14.9%～33.4%的去除率。在三种增菌剂中，木屑是两种粪肥中去除抗生素最有效的促进剂，稻壳在降低鸡粪中ARGs的效果最好。李灵章等[12]以玉米秸秆、水稻壳和鸡粪、牛粪为原材料，两两组合进行高温好氧堆肥。结果表明，鸡粪+秸秆处理的温度的峰值较高，持续高温的时间更长；采用秸秆与鸡粪或牛粪组合的堆肥腐熟度高，产物的营养性质和应用效果好，适合在农业生产中进行推广和应用。张浩然等[13-14]分别从生物炭的应用进行了研究，发现生物质炭的丰富的孔隙结构和表面含氧官能团、比表面积大可显著改善堆体的理化性质和生物学特性，进而有利于微生物的生存，促进矿化和腐殖化作用，进而调节了堆肥品质。Lu等[15]研究了在猪粪堆肥中添加不同比例的煤气化炉渣(0，5%和10%)对ARGs的影响，发现添加10%的煤气化炉渣能够去除5/11的ARGs。Cao等[16]研究探讨了在堆肥65 d后，三种添加水平(5%，10%，15%)的褐煤对鸡粪堆肥中ARGs降解酶和细菌群落的影响，对照(不含褐煤)中ARGs的相对丰度降低了8.9%，褐煤处理(5%，10%和15%)中ARGs的相对丰度分别降低了15.8%，27.7%和41.5%。Zhang等[17]在污泥堆肥中添加天然沸石、添加3，4-二甲基吡唑磷酸盐的硝化抑制剂(DMPP)对ARGs水平的影响进行对比实验。结果表明，在反应器中加入DMPP和空白对照组后总ARGs的相对丰度分别富集了2.04倍和1.95倍。虽然有些ARGs(ermB、ereA和tetW)在污泥堆肥后减少了，但其他大部分ARGs在污泥堆肥后会增加。Peng等[18]研究在堆肥中添加沸石的ARGs的含量比不添加组减少了67.3%，且加入沸石的比加入过磷酸钙的对照组降低了更多的ARGs和整合子，因此沸石有助于降低粪便中的ARGs。

不同辅料在不用底物堆肥的过程中对ARGs的去除效果不同，其次相同辅料不同含量对ARGs的去除效果也不同。由上可知，在好氧堆肥中添加生物炭、天然沸石、木屑秸秆等会明显降低污泥堆肥中ARGs的相对丰度，降低其环境风险，提高了堆肥的品质。其中沸石对降低ARGs的丰度效果最优，其次是木屑。稻壳对降低鸡粪中ARGs的相对丰度效果最优。在一定程度上会降低含较高浓度的抗生素的固体废物中的ARGs的总相对丰度，主要是由于细菌群落的变化影响了ARGs的变化。由于抗生素种类不同，添加辅料后部分ARGs减少，但仍有一部分ARGs不同程度的增多。因此，有必要追究堆料来源和堆肥是否影响土壤中固体废弃中承载的ARGs的命运，特别是在长期施肥历史不同的情况下。

1.1.2 零价纳米铁和氯化铁 铁元素对人类身体健康有重要影响，含铁的肥料使土壤含量丰富，使农作物中的含铁量增加，被人类食用后利于补充人类所需的物质。又因为氯化铁、零价纳米铁自身特点，通过对作物进行吸附、氧化等作用常被用于去除水中、土壤中的各种污染物。诸多科研人员研究了将氯化铁、纳米铁加入好氧堆肥后促进堆肥微生物的生长和对ARGs消长的影响等。

Guo等[19]研究了在堆肥中添加氯化铁，提高了堆肥过程中微生物的活性，减少了ARGs的富集，有利于ARGs的去除，表明氯化铁可以降低堆肥产品中膜转运和信号转导分子的丰度。表明加入氯化铁可能会抑制堆肥中ARGs的转移。Wang等[20]研究了在堆肥中添加0，100，1 000 mg/kg的零价纳米铁对猪粪堆肥过程中ARGs和MGEs的影响，堆肥后sul1、sul2、dfrA7、ermF和ermX的相对丰度分别下降了33.26%和99.31%，intI2和Tn916/1545的相对丰度分别下降了95.59%和97.65%。Ma等[21]证明了零价纳米铁可以显著改善四环素的降解，在大多数系统中去除率超过90%。

诸多研究发现在堆肥中添加零价铁、氯化铁等，有利于ARGs的去除。由于微生物是ARGs的主要载体，微生物群落的演替明显影响ARGs的命运。在零价纳米铁添加量不同时，微生物群落的变化不同，微生物群落的差异也影响ARGs的命运。综上所述，零价纳米铁和氯化铁可以作为一种环境友好的添加剂，通过影响MGEs而降低堆肥中ARGs的相对丰度；尤其在100 mg/kg的零价纳米铁对四环素类中的ARGs的去除效果最优，对后续强化好氧堆肥对ARGs的去除效果的研究提供了一种思路，确定了多种常见且易难去除的ARGs及其细菌群落的影响之间的关系，为今后的实际应用提供了理论基础。

1.2 生物菌剂

在实验室条件下评估堆肥过程中残留的抗生素和ARGs，传统方法往往无法从堆肥最终产品中去除ARGs[22-23]。传统的好氧堆肥对ARGs的去除效果不理想；又因为好氧堆肥中有丰富的微生物，可通过增加堆肥过程中的微生物活性来促进堆肥的成熟，此方法也逐渐被广泛应用。

巨大芽孢杆菌作为一种众所周知的溶磷接种剂已广泛用于农业和肥料制造[24-25]。Guo等[19]研究了在堆肥中添加微生物菌剂，增加了堆肥中微生物的种类和活性，有利于堆体中的ARGs的去除；Yang等[26]在堆肥中添加复合微生物菌剂后可提高高温分解温度，延长高温分解周期4 d。与对照相比，接种复合菌剂可使纤维素酶、脲酶和多酚氧化酶活性分别提高15.0%～19.8%，2.3%～71.4%和0.3%～28.4%。

由于传统的好氧堆肥的温度不够高，一般最高在50～70 ℃内，不能有效地去除所有病菌和ARGs。现已有大量研究表明提高堆肥温度可以显著缩短堆肥的发酵周期，加快堆肥腐殖化进程。2008年，日本科学家Oshima在传统污泥堆肥中添加极端嗜热微生物，在自然条件下使堆体温度达到90 ℃以上，可大大缩短堆肥周期、提高堆肥腐熟转化效率[27-28]。Liao等[29]探讨长期(不少于6 d)暴露于60 ℃以上的超高温堆肥，去除泰乐菌素抗生素发酵残留物(TFR)的95.0%和75.8%的相关ARGs和移动遗传元素(MGEs；质粒、整合子和转座子)的98.5%，反映出超嗜热堆肥通过减少抗生素抗性质粒和相关宿主细菌的丰度，有效地从抗生素发酵废物中去除相关的ARGs。

总之，添加复合菌剂提高了堆肥过程中细菌群落的多样性，从而促进了细菌群落结构的演替，提高了堆肥的质量和效率；缩短了堆肥过程的持续时间，提高了腐熟率；提高了纤维素酶、脲酶和多酚氧化酶的活性水平。通过添加极端嗜热菌后的超高温堆肥在去除抗生素和抗生素残留物、重金属和相关的ARGs和MGEs是高效的；同时表明，超嗜热堆肥是一种在工业规模上处理高浓度抗生素发酵废物的成功策略，对与多重耐药质粒相关的细菌宿主具有负面影响；超高温堆肥缩短了堆肥时间，使ARGs的相对丰度大大降低。

2 好氧堆肥中影响ARGs迁移的主要因素

在堆肥过程中，细菌群落(包括ARGs和MGEs的宿主)随着物理化学因素(如营养物质)的变化而发生显著变化，并导致其携带的ARGs和MGEs的变化。经调查发现重金属、细菌群落对ARGs在较高浓度抗生素中的废弃生物质的影响。堆肥处理显著改变了细菌群落的丰度、组成和多样性，去除部分ARGs和MGEs的相对丰度，但仍有大部分ARGs的总丰度增加。

2.1 重金属

然而，铜、锌等重金属是促进生长和提高饲料效率的重要元素，然而重金属在动物肠道中的吸附性很差，大部分铜在尿液和粪便中的排泄没有变化，故在畜禽粪便、抗生素菌渣中大量存在。继而使其进行堆肥，重金属留在堆肥产品。又因为重金属在堆肥过程中不能被降解，因此可能在抗生素耐药性的扩散中造成持续的共选择压力。由于有些钝化剂中存在重金属，导致ARGs中的重金属含量较高，导致环境中更高的潜在风险。

Yin等[30]指出在堆肥过程中，多种重金属特别是铜和锌AFDs和堆肥原料中所含的重金属会影响ARGs、金属抗性基因(MRGs)和微生物群落组成，并指出重金属使ARGs的丰度升高。Qian等[31]对三种典型的钝化剂(生物炭、粉煤灰和沸石)应用于富含铜猪粪的堆肥过程中，所有钝化剂处理比空白组降低了至少6种ARGs和2个MGEs的26%～85%。但铜抗性基因的丰度没有被钝化剂降低，这意味着降低铜的共选择压力可能不是ARGs降低的主要原因。Zhang等[32]研究采用不同铜添加浓度的泰乐菌素发酵残渣和污泥好氧堆肥，结果表明，两种浓度的铜不仅影响非生物因子，而且影响抗性基因的相对丰度。高浓度铜抑制微生物群落的代谢能力和固氮过程，ermT、mefA、MfA的丰度增加部分归因于MRGs反映的重金属的毒性效应和共选择压力。Wu等[33]发现ARGs、MRGs和MGEs主要受环境因子和微生物群落共同作用的驱动。在堆肥样品中检测到了不同的金属硫蛋白，这些金属硫蛋白对砷、镉、钴、锌、铜、汞、铅和碲等重金属具有抗性。这意味着，特定重金属施加的选择压力可能并不总是导致目标基因的相应变化，因为MRGs的变化是由多种因素驱动的，如MGEs和细菌群落。

Sun等[34]探讨了红霉素菌渣(EMW)和猪粪以0(对照)、5%(低)和20%(高)的比例混合堆肥后，大多数处理的erm基因相对丰度(RAs)降低了 77.75%～99.97%。高EMW对erm基因的去除有负面影响，与对照和L组相比加剧了ARGs的富集，说明Zn的浓度到一定值后对ARGs有了促进的作用。Peng等[35]研究探讨了猪粪和绿茶残渣(GTRs)进行混合堆肥后，GTRs的添加有效地促进了大多数靶向ARGs(tet和sul基因)、可移动遗传元件(MGEs，intI1)，以及金属抗性基因(MRGs，pcoA和tcrB)的减少。经网络分析表明，厚壁菌门和放线菌门是ARGs的主要宿主，MGEs和MRGs共享相同的潜在宿主菌，GTRs影响细菌群落，从而影响ARGs分布的变化，降低与堆肥产品相关的潜在风险。

综上所述，重金属对粪肥、菌渣等含较高浓度抗生素的固体废弃物中ARGs的影响未有明确的去除结论，在不同浓度不用种类的金属中对ARGs的去除效果可能有呈正相关，可能会有逆相关；又由于ARGs的变化由多种因素决定，重金属对ARGs的影响仅是一方面。重金属铜、锌和ARGs等环境因子之间存在显著相关性。研究发现铜的添加显著增加了部分ARGs的总丰度(3种ARGs的丰度显著高于未添加铜组)，说明铜可以引起堆肥过程中部分ARGs的变化。此外，在不同浓度的铜下，ARGs的丰度也存在显著差异，这说明铜会增加ARGs的生态风险。研究表明ARGs的进化受其细菌宿主的极大影响，添加铜、锌等重金属可以在某种程度上驱动这些抗性基因中细菌宿主的选择，这也可能抑制宿主对特殊环境的适应，且重金属的存在减少了堆肥系统中细菌的群落结构。因此，由于长期的共选择压力，ARGs的传播可能会增加。铜、镍、锌等重金属都是对大多数抗生素具有抗性的菌株的潜在的共选择剂，并且由于许多病原体携带ARGs和MRGs，增强了潜在的共选择功能；浓度不同的铜处理组之间intI1均显著增加，这表明重金属可能影响ARGs并增加共复合过程中的生态风险。因此，重金属的存在需要共堆肥过程中加以控制。

2.2 细菌群落

大量研究表明，微生物被认为是ARGs传播的主要载体，ARGs的变化受到微生物演替的显著影响[36-37]，因此，细菌群落演替可能是所有混合堆肥条件下ARGs不同命运的主要驱动力。不同ARGs的差异可能归因于不同的细菌；在混合堆肥过程中，ARGs剖面的变化与细菌群落的组成之间有很强的关系，即微生物的多样性和结构是影响不同环境(如河流、土壤、污水污泥和地下水)中ARGs动态的关键生物因素。ARGs在堆肥中的动态见图2。

图2 堆肥后的ARGs流程图Fig.2 Flow chart of ARGs after composting

Li等[38]说明了单个ARGs和微生物分类群(基于前20个属)之间的详细关系，表明不同ARGs的差异可能归因于不同的细菌及ARGs的变化与细菌群落的组成之间有很强的关系。SARDAR等[39]在堆肥中发现，细菌多样性发生了显著变化。Cao等[40]发现在堆肥中细菌群落在门和属水平上呈现出显著的时间变化，在网络分析中总共发现了123个正相关，包括52个强相关。一些ARGs与同一属呈正相关，这进一步证明了在堆肥过程中多种ARB的存在和ARGs的共存。

总之，在好氧堆肥过程中含有频繁的HGT过程、多种ARGs宿主、多种ARB和ARGs的共存，而ARGs与理化因子之间的相关性较弱，这意味着潜在的健康和环境风险。不同的ARGs与同一宿主菌之间的正相关，表明了不同的ARGs的共存，进一步得出细菌群落对ARGs进化的主要影响。研究发现细菌群落与ARGs的丰度显著相关，微生物群落对混合堆肥过程中ARGs的变化有影响。在不同处理下堆肥对微生物群落结构有显著影响，并且在混合堆肥过程中观察到放线菌和变形菌相对丰度的降低，进而混合堆肥过程中部分ARGs的去除。堆肥过程中与细菌群落相关的ARGs分布，在不同阶段的细菌群落中发现了相似的ARGs时间模式，这证实了细菌群落组成与ARGs密切相关，即ARGs的变化受到微生物演替的显著影响。因此，细菌群落演替可能是所有混合堆肥条件下ARGs不同命运的主要驱动力，如果ARGs和共存的微生物群落具有显著的正相关性，那么微生物群落和ARGs之间的共生模式可用于发现对ARGs及其可能宿主的新想法。细菌群落与ARGs的相关性表明细菌群落在控制ARGs变异中起重要作用。驱动ARG流行的关键因素包括它们的宿主细菌(假单胞菌属、克雷伯氏菌属和卤菌属)和堆肥变量(总有机碳、总氮、氨氮和酸碱度)。这些发现为更好地控制抗生素菌渣、畜禽粪便中的ARGs提供了思路。进一步的工作可以筛选功能性微生物以提高堆肥过程中ARGs的去除。

3 结论与展望

ARGs作为一种新型污染物，用好氧堆肥处理ARGs，已取得显著效果且应用广泛。通过外源添加物促进好氧堆肥已逐渐成熟，现如今用含较高抗生素浓度的抗生素菌渣、畜禽粪便、污泥等作为底料进行堆肥研究较多且对ARGs的去除效率较好；而不同重金属不同浓度下的对多种ARGs的影响效果不同；对不同的ARGs与同一宿主菌之间的正相关，表明了不同的ARGs的共存，进一步得出细菌群落对ARGs进化的主要影响。本文在众多研究成果的基础上，展望如下：

(1)进一步探究如何提高抗生素菌渣好氧堆肥去除ARGs的效率，并对其工艺条件进行优化、抗生素降解菌的分离以及探索低成本材料的应用。

(2)不同重金属不同浓度下的对多种ARGs的影响效果不同，进一步研究重金属对众多ARGs的影响因素及机理。

(3)通过外源添加物促进好氧堆肥已逐渐成熟，然而由于ARGs与重金属、HGT、MGE及细菌群落的复杂的关系还未明确。好氧堆肥体系内微生物群落的变化是ARGs消长的主要驱动因子，确定ARGs的潜在宿主菌是目前研究的难点，后期应进一步明确和分析ARGs变化的机理和确定ARGs的潜在宿主菌。