兔H-Y抗血清的制备和验证

李孝初，袁秀芳，苏菲，余斌，李军星，叶十一，徐丽华*，肖琛闻*

(1.宁波鄞州中铭农业科技有限公司，浙江 宁波 315000；2.浙江省农业科学院 畜牧兽医研究所，浙江 杭州 310021)

Eichwald和Silmsersl于1955年利用纯系C57BL/6小鼠进行皮肤移植试验时首次发现H-Y抗原[1]。这种抗原属于次要组织相容性抗原，在哺乳动物中是雄性个体中特异基因的表达产物[2]。H-Y抗原的发现，引起了H-Y抗原对精子选择和胚胎性别鉴定的广泛研究[3]。虽然利用杂交瘤细胞技术获取的H-Y单克隆抗体具有纯度和效价高的优点，但由于H-Y抗原亚型多，单克隆抗体筛选的机遇性极大，研究周期长，技术难度大，因此难以成功[4]。在实际中，大多仍以动物制备多克隆抗H-Y抗体。本试验探索以不同兔H-Y抗原的提取和免疫接种程序来制备兔H-Y抗血清，并用ELISA法测定抗血清效价，用所制备的抗血清以Western-blot技术检测兔睾丸H-Y抗原组分。

1 材料与方法

1.1 试验动物

从浙江省农业科学院种兔场选取2组同窝生新西兰试验兔8只(第1组1公3母；第2组2公2母)，每只体重1.5～2.0 kg，3～4月龄。委托浙江省农业科学院种兔场进行常规饲养管理，试验起始于1月，结束于7月。

1.2 睾丸H-Y抗原的制备

将公兔放血致死，无菌操作取出睾丸，立即置冰浴上剥离被膜和附睾，将睾丸剪成小块，置无菌的5 mL玻璃匀浆器中，按1∶5加入预冷的0.01 mol·L-1PBS，冰浴制取匀浆，4 ℃ 2 000 r·min-1离心10 min，取上清用Lowery法测定蛋白浓度。分装于1.5 mL小试管，-70 ℃保存备用。

1.3 免疫方法和程序

免疫前每只试验兔分别采血约5 mL，分离血清，用作阴性血清对照，-70 ℃保存备用。每次免疫时从-70 ℃取出H-Y抗原适量，等量加入完全弗氏佐剂，用超声波完全乳化备用。试验共分2组，每组用公兔睾丸H-Y抗原免疫同窝母兔，以减少个体间抗原反应，提高获取抗H-Y抗血清的可能性。

第1组试验兔背部分2点皮下注射0.5 mL，然后每隔2周同法加强免疫一次，剂量相同，共免疫5次。将H-Y抗原加入等量不完全弗氏佐剂，用超声波混合乳化完全，最后加强免疫一次，剂量同前，免疫后隔10 d，兔子采血致死，分离血清，每兔各得约20 mL抗血清，于-70 ℃保存备用。

第2组试验兔第一次足垫注射免疫同窝2母兔，每只0.5 mL，然后每周皮下加强免疫一次，共免疫5次，剂量相同，最后一次免疫后，隔2周，分别采血致死，分离血清，每兔各得约20 mL抗血清，于-70 ℃保存备用。

1.4 H-Y抗血清的效价测定

从-70 ℃取出兔睾丸H-Y抗原，以NaHCO3/Na2CO3缓冲液稀释至0.01 mg·mL-1，包被96孔酶标板，每孔100 μL，4 ℃过夜。取出酶标板，用5%脱脂奶粉封闭1 h。用pH 7.2的0.01 mol·L-1PBST洗涤3次。每孔加入1∶50稀释的抗血清100 μL，37 ℃作用1 h，同法洗涤3次。再加入酶标SPA，37 ℃作用1 h后洗涤3次，用OPD+H2O2显色，最后用2 mol·L-1H2SO4终止液(各50 μL)终止反应。用酶标仪于490 nm处测定D值,计算抗血清效价。

将上述取得的H-Y抗血清分别取15 mL，使用精子细胞毒性分析法测定H-Y抗血清的效价。

1.5 Western-blot检测兔H-Y抗原组分

从-70 ℃取出睾丸H-Y抗原液适量，加入等量2×SDS上样缓冲液混匀，煮沸3 min，高速离心后备用。同时制备12% SDS-PAGE，每孔上样10 μL，120 V恒压电泳2 h。电泳完毕，取出凝胶，立即进行电泳转移至硝酸纤维素薄膜上，4 ℃ 30 V恒压电泳过夜。

取出硝酸纤维素膜，用5%脱脂奶粉封闭1 h，用0.01 mol·L-1PBST洗涤3次，加入1∶50稀释的抗血清，37 ℃作用1 h；同法洗涤3次，再用酶标SPA作用1 h，同法洗涤后用DAB+H2O2显色。

2 结果与分析

2.1 睾丸H-Y抗原蛋白浓度

本研究选取的2窝试验兔，分别取睾丸，研磨成匀浆，离心后用Lowery法测定蛋白浓度，第1组H-Y抗原蛋白浓度为28 mg·mL-1，第2组为24 mg·mL-1。

2.2 ELISA法测定兔H-Y抗血清效价

用提取的睾丸抗原包被酶标板后，分别用免疫前血清和免疫后血清进行倍比稀释，按常规操作进行ELISA法检测，最后于波长490 nm处测定D值。结果(图1)表明，0830#兔子免疫前和免疫后D值变化较明显，抗体效价在1∶100以上；其余4只试验兔免疫前和免疫后D值变化不明显。

图1 兔H-Y抗血清效价

用提取的睾丸抗原包被酶标板后，分别用免疫前血清和免疫后血清进行倍比稀释，按常规操作进行ELISA法检测，最后于波长490 nm处测定D值。结果表明，0830#兔子免疫前和免疫后D值变化较明显，抗体效价在1∶100以上；其余4只试验兔免疫前和免疫后D值变化不明显。

2.3 Western-blot验证

免疫的2组试验兔，第1组有3只，抗血清编号为0829#、0830#、0889#；第2组有2只，抗血清编号为0337#、0397#。第1组试验中，4次免疫后采血，进行琼脂扩散试验，无条带，再加强免疫一次后采血。将5份抗血清分别进行Western-blot，最后显色观察，只有0830#兔抗血清作用的硝酸纤维素薄膜出现一条较弱的特异性条带，另外的4个抗血清均无条带出现(图2)。

图2 兔睾丸提取液的SDS-PAGE和Western-blot验证

3 小结与讨论

哺乳动物的性别由性染色体决定，雌性的性染色体为“XX”，雄性的性染色体为“XY”。根据这个特性，我们可以先分离X和Y精子，再通过人工授精的办法有效地达到性别控制的目的。1955年在同一品系小鼠不同雌雄个体间进行皮肤移植时发现，雌性小鼠对雄性小鼠的皮肤移植有强烈地排斥反应[5]，这种现象源于一种雄性特异性的抗原，称之为Y染色体组织相容性抗原(Y-chromosomal histocompatibility antigen)，简称“H-Y抗原”。Billingham等在1968年进一步证实，H-Y抗原是一种结合在细胞表面的糖蛋白，存在于所有哺乳动物含有Y染色体的雄性细胞表面。许多科学家对H-Y抗原的特异性进行了系统分析，结果推测H-Y抗原是一种弱抗原，由多个抗原表位组成，而每一个抗原表位仅有8～11个氨基酸。Greenfield等[6]报道，在小鼠上已经鉴定出4个H-Y抗原表位，其中2个H-Y抗原表位的编码基因均为Smcy，一个编码基因为Uty，第4个表位的编码基因目前未知。其中Smcy和Uty表位基因在X染色体上的同源基因分别为Smcx和Utx，而在小鼠中这2个基因表达的抗原表位与H-Y基因的差异比较大。H-Y抗原表位在人类中鉴定出2个由Smcy编码的H-Y抗原表位，其中一个表位与同源基因Smcx编码的多肽仅差2个氨基酸。在精子中，H-Y抗原主要存在于精子顶体，附睾头分离的精子其H-Y抗原主要分布于靠近精子的尾部，附睾尾分离的精子其抗原主要分布于顶体后端。很多试验证实只有Y精子才能表达H-Y抗原。H-Y抗原的发现开辟了利用抗原抗体反应原理进行性别控制的新途径，由H-Y抗体识别H-Y抗原，再通过一定分离程序将精子分离成X精子和Y精子，再选择其中一种精子进行人工授精后得到所需性别的后代。

国内对H-Y单克隆抗体的研究已有多年历史。小鼠H-Y抗原已被发现与多种动物发生交叉反应，包括人类、大鼠、兔、狗、鼹鼠、田鼠、鸟类、青蛙，甚至龙虾、甲虫、蟑螂和硬骨鱼等无脊椎动物[7]。牛树理等[8]采用间接ELISA条件提高灵敏度，建立检测H-Y抗体的检测方法。利用纯系BALB/c公鼠免疫同系母鼠制备H-Y单抗，间接免疫荧光法鉴定胚胎性别PCR方法验证准确率。结果表明，在18枚H-Y阳性胚胎中有15枚雄性胚胎和3枚雌性胚胎准确率为83%，在16枚H-Y阴性胚胎中有15枚雌性胚胎和1枚雄性胚胎准确率为94%。杭苏琴等[9]以纯系BALB/c雄性小鼠脾细胞腹腔注射免疫同系雌性小鼠9次，获得的抗血清经雌、雄鼠脾细胞吸收后用于精子细胞毒性试验，测得H-Y抗血清效价为1∶160。本次试验选取体重相近的全同胞新西兰兔，进行不同程序的免疫方式制备兔H-Y抗血清，结果5只受免疫的兔子中，只有0830#兔子产生较高效价的抗体滴度，并在Western-blot中出现一条较弱的特异性条带。说明不同的免疫方法，其免疫效果也有很大差别。而同窝公兔睾丸提取液免疫同窝母兔，其产生抗血清的效价也不同，说明个体对H-Y抗原的敏感性也有很大的差异。

根据资料报道，H-Y抗原是一种弱组织相容性抗原，对不同动物的反应差异较大，免疫效果较差，产生的抗血清效价不高，一般获得的效价只有1∶4～1∶16。而用本试验所制备的兔H-Y抗原，以不同免疫程序，多点免疫，多次免疫，结合使用佐剂免疫等方法，最后获取的效价较高，ELISA检测效价在1∶100以上，兔H-Y抗血清制备获得初步成功。对H-Y抗体效价的测定中，以往都是采用间接免疫荧光分析法、精子细胞毒性分析法和囊胚形成抑制法等方法，但这些方法都存在一定的不足之处。间接免疫荧光分析法准确率低，特异性差；精子细胞毒性分析法需要采集活精子进行试验，眼观判定精子活力，结果的重复性和准确性不强。而本试验探索建立ELISA法，检测H-Y抗血清的效价滴度，为H-Y抗血清效价的测定提供了一种新的检测方法。

本试验通过Western-blot技术，检测到兔睾丸H-Y抗原有一条分子量约为90 ku的反应条带。SDS-PAGE显示兔睾丸提取液中蛋白成分极为复杂，而Western-blot仅检测到一条显色带，特异性极强，该蛋白很可能就是H-Y抗原的主要成分。但据报道，人的H-Y抗原基因的mRNA为4 619 bp[10],鼠的H-Y抗原基因的mRNA为4 655 bp，其对应蛋白的理论分子量约为170 ku[11]，与本试验检测到的分子量差异很大，造成此结果的原因有待进一步验证，可能是因为在兔睾丸H-Y抗原制备过程中蛋白发生部分降解。