益母草转化酪醇合成红景天苷的研究

赵滋润，罗月芳，高娜娜，吴琼，谭朝阳，徐德宏

(湖南中医药大学 生物工程实验室，湖南 长沙 410208)

红景天苷(salidroside)是一种由对羟基苯乙醇(又称为酪醇)和葡萄糖化合形成的糖苷，其化学名为对羟基苯乙基-β-D-葡萄糖苷，首先发现于红景天属植物中，随后在女贞属、杜鹃属、越橘属等植物中也有发现[1]。药理学研究表明，红景天苷是红景天属植物最重要的药效成分，具有良好的抗疲劳、抗缺氧、抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、增强免疫力、保护心血管、保护神经元等多种功效[2]，因其作为主要成分的医药保健产品被广泛的开发与应用[3]，导致当前市场对其需求量不断增加，因而如何既经济又高效地获取红景天苷，已成为医药研究者亟待解决的问题。

红景天属植物是提取红景天苷的主要来源，但一方面由于该属植物野生资源匮乏，另一方面人工栽培时由于红景天种子成熟度差、发芽率低，种植所需生长环境要求高，根腐病较严重[4-5]，导致当前原材料的供应难以满足大规模提取的需求。化学合成是获取红景天苷的另一种方法，此法虽不受原材料的限制，但由于红景天苷含葡萄糖基，需经过多步保护和去保护措施，致使整个合成过程复杂且产率不高，副产物多且难于分离，故化学合成红景天苷有待进一步改进[6]。

采用生物技术对药用活性物质进行生物合成是一种经常采用的手段，目前人们对红景天苷的生物合成主要有红景天属植物组织或细胞培养法[7-9]、生物酶法[10-11]、微生物合成法[12]等。本课题组前期研究发现，通过供给外源性的酪醇，少部分植物在生长过程中可吸收并转化苷元生成红景天苷，其中唇形科植物益母草(LeonurusjaponicasHoutt.)在自然生长状况下不含红景天苷，但对其进行含酪醇的水培时，能较好地将酪醇转化为红景天苷。故本文对益母草水培和悬浮细胞培养转化酪醇生成红景天苷的条件进行探讨，从而为益母草生产红景天苷，以及开发益母草相关的医药保健产品奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

益母草(LeonurusjaponicusHoutt.)成熟种子由湖南中医药大学药用植物教研室王智老师在湖南中医药大学药用植物园采集并鉴定。

红景天苷标准品购自中国药品生物制品检定所(批号110818-201005)；酪醇购自武汉金诺化工有限公司(批号GPC-13JNHG0123A)；琼脂购自福建省石狮市高新琼脂有限公司；甲醇为色谱纯，其余化学试剂均为分析纯，都采购自国药集团化学试剂有限公司。

天津市泰斯特仪器有限公司的GZX-450光照培养箱；天津市欧诺仪器有限公司的双层恒温培养摇床；日本岛津公司的LC-16高效液相色谱泵；日本岛津公司的SPD-M20A检测器；日本岛津公司的SIL-16自动进样器；美国沃特世科技公司的Waters Xevo G2-XS QTof 高分辨质谱；苏州净化设备有限公司的SW-CJ-2D型双人净化工作台；天津市泰斯特仪器有限公司的COND电导率仪；上海雷磁科学仪器有限公司的pH计。

1.2 益母草转化酪醇生成红景天苷的水培研究

益母草水培营养液采用华南农业大学叶菜B配方[13]进行配制。

取益母草种子，经0.1%的高锰酸钾溶液浸泡消毒1 min，用水冲洗后，浸泡6～8 h，播种于装有椰糠的不锈钢盘中，用水浇灌，待发芽之后，用0.5倍营养液及蒸馏水交替浇灌保湿。幼苗长至3～4片真叶后，取出，用海棉将根包裹，移至定植篮中，放入水培箱中进行培养。初期用0.5倍营养液，然后逐渐过度至1倍营养液，每日用气泵通气2次，并监测水培液的电导率和pH，定期更换，培养60 d后的益母草植株可用于实验。

取大小长势基本一致的水培益母草植株，分为3组，每组2个水培箱(500 mm×380 mm×228 mm)，每箱12株益母草，每个水培箱中装入10 L 1倍营养液，于8：00在3组水培箱营养液中加入酪醇，使其终浓度分别为1、3、7 mmol·L-1，每天18：00取样，每箱采1株益母草，共采集10 d。取益母草的叶，检测红景天苷含量，同时取未施加酪醇的益母草叶作为空白对照，同法检测。

水培益母草植株分为3组，于8：00分别喷洒浓度为0.2%(14.3 mmol·L-1)、0.5%(36.2 mmol·L-1)、0.8%(57.9 mmol·L-1)的酪醇溶液于益母草植株的叶面和叶背上，以喷湿叶片为度，每天18：00取样，每箱采1株益母草，共采集10 d。取益母草的叶，检测红景天苷含量。

水培益母草植株分为3组，8：00分别对3组益母草按不同方式施加酪醇，A组在水培液中加入酪醇，使其浓度为2 mmol·L-1，B组向益母草叶片喷洒0.5%(36.2 mmol·L-1)的酪醇溶液，C组在水培液中加入酪醇，使其终浓度为2 mmol·L-1，同时在益母草叶片上喷洒0.5%的酪醇溶液，每天18：00取样，每箱采1株益母草，共采集10 d。取益母草的叶，检测红景天苷含量。

1.3 益母草转化酪醇生成红景天苷的悬浮细胞研究

根据李学栋等[14]的方法进行益母草愈伤组织的培养，并按罗月芳等[15]的方法建立益母草悬浮细胞系。

酪醇母液用过滤法除菌，无菌条件下，向益母草悬浮细胞转化体系中添加适量酪醇母液，使转化体系中酪醇终浓度为1、3和7 mmol·L-1，添加后分别在24、48、84 h收获。将收获的益母草悬浮细胞培养液处理，并测定红景天苷含量和计算转化率。

酪醇母液用过滤法除菌，无菌条件下，向益母草悬浮细胞转化体系中添加适量酪醇母液，使转化体系中酪醇终浓度为3 mmol·L-1，添加后每隔一定时间取样。将收获的益母草悬浮细胞处理，并测定红景天苷含量和计算转化率。

1.4 红景天苷含量测定和转化率计算

取益母草鲜叶，精密称定10 g，剪碎，精密加入50%甲醇15 mL，称量，80 ℃水浴回流提取1 h。冷却称重后，用50%甲醇补足失量，过0.45 μm滤膜，取滤液作为益母草水培植株的供试品溶液。

益母草悬浮细胞培养液经抽滤后，上清液经0.45 μm滤膜过滤后，作为胞外供试品溶液。抽滤得到的细胞用水清洗3遍，加入10倍量70%甲醇，称重，80 ℃水浴回流提取1 h。冷却称重后，用70%甲醇补足失重，过0.45 μm滤膜，取滤液作为胞内供试品溶液。

取红景天苷标准品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1 mL含0.05 mg的溶液，制备红景天苷标准品溶液。

色谱柱为C18色谱柱(太玮科技JADE-PAK®ODS-AQ，4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为甲醇-水(12∶88)；检测波长为275 nm；流速为1.0 mL·min-1；柱温30 ℃；进样量为20 μL。

转化产物的液质联用(HPLC-MS)检测色谱柱为Agilent ZORBAX Bonus-RP(150 mm×4.6 mm，3.5 μm)；流动相为甲醇-0.1%甲酸溶液(6∶94)；流速为0.5 mL·min-1；检测波长为275 nm；进样量为10 μL；柱温为40 ℃。质谱检测采用正离子模式，电喷雾质谱干燥气流速为6 L·min-1；喷雾器压力为275.8 kPa；雾化气温度为325 ℃；鞘气温度为350 ℃，鞘气流速为12 L·min-1，毛细管电压为4 000 V；碎裂电压为110 V，质谱采集范围为50～1 000m/z，碰撞电压为20、10 eV。

利用外标一点法进行红景天苷产量计算，W=A(W)/(A)，其中W与A分别代表供试品中红景天苷的含量及相应的峰面积。(W)及(A)分别代表在标准品中红景天苷的含量及相应峰面积。

红景天苷总转化率和红景天苷总产量计算公式如下：

红景天苷总产量=胞内所含红景天苷的产量+胞外上清液中红景天苷的产量；

红景天苷总转化率=(胞内所含红景天苷的摩尔数+胞外上清液中红景天苷的摩尔数)/加入培养体系中酪醇的总摩尔数×100%。

2 结果与分析

2.1 益母草水培结果

2.1.1 益母草水培植株可转化酪醇生成红景天苷

在益母草水培营养液中添加酪醇后，经过一段时间的转化，利用HPLC对植株体内是否生成红景天苷进行检测，结果显示，在添加酪醇的植株体内检测到红景天苷的生成，而未添加酪醇的植株则无红景天苷产生(图1)。

A—红景天苷标准品；B—施加酪醇的益母草；C—未施加酪醇的益母草。图1 益母草水培植株转化酪醇生成红景天苷的HPLC结果

对施加酪醇的益母草与红景天苷标准品具有相同保留时间的色谱峰进行质谱检测，测得其一级质谱(M+Na)m/z为323，二级质谱测得其主要碎片离子m/z为121、170、251，均与红景天苷标准品相同(图2)，因而可以确定益母草中新转化合成的物质为红景天苷。

A—红景天苷标准品一级质谱；B—益母草中红景天苷的一级质谱；C—红景天苷标准品二级质谱；D—益母草中红景天苷的二级质谱。图2 益母草水培植株转化酪醇生成红景天苷的质谱检测结果

水培液中添加酪醇后，当天益母草叶中就可检出红景天苷，随后含量逐渐增加，在3～4 d达到最高。总体来说，添加酪醇的浓度越高，益母草体内转化合成的红景天苷含量也越高(图3)。但在7 mmol·L-1组中，益母草在添加酪醇2 d后叶片开始出现枯萎现象，随着时间的推移个别植株死亡，并观察到益母草根系腐烂发黑，说明高浓度的酪醇对益母草根系造成了严重损伤，影响了根系吸收功能。综合考虑以上情况，水培液中添加酪醇浓度以3 mmol·L-1为佳。

图3 水培液中不同酪醇添加量的转化结果

2.1.2 益母草植株可由叶吸收酪醇生成红景天苷

如图4所示，益母草叶面喷洒酪醇后，同样很快就能转化合成红景天苷，其中喷洒0.8%酪醇组的益母草在2 d后叶面开始出现黑色斑点，整体长势较差，个别植株出现死亡，其他2组无此现象，说明高浓度的酪醇对益母草植株有较大的损害作用。此外，0.8%酪醇组转化生成红景天苷的含量2 d即达最高值，随后下降很快，甚至比0.5%组还低，这说明0.5%酪醇溶液为最佳喷洒浓度。

图4 叶面喷洒不同浓度酪醇的转化结果

2.1.3 不同酪醇施加方式会影响红景天苷生成量

如图5所示，B组红景天苷含量始终高于A组，说明叶面喷洒比水培添加更有利于红景天苷的生成。对于C组，前9 d的红景天苷产量高于A、B 2组，但在水培过程中观察发现，植株随着水培时间延长，叶片枯萎、植株倒伏现象逐渐严重，说明水培添加结合叶面喷洒的方式，使益母草根系和叶面受损情况比其他2组要严重，因而在2种方式同时处理益母草时，应以喷洒0.5%酪醇溶液为主，再辅之以低浓度(<2 mmol·L-1)的酪醇水培液，这样就能更好地促进益母草转化酪醇生成红景天苷。

图5 酪醇不同施加方式的转化结果

2.2 益母草悬浮细胞结果

2.2.1 益母草悬浮细胞系的红景天苷产量受酪醇浓度影响

不同浓度酪醇对益母草悬浮细胞系红景天苷总产量和细胞鲜重的影响如图6所示。在不同时间点采集的益母草悬浮细胞中，3 mmol·L-1组的红景天苷总产量最大，其次是7 mmol·L-1组，最小为1 mmol·L-1组；细胞鲜重在不同时间点则是1 mmol·L-1组最大，其次是3 mmol·L-1组，最小是7 mmol·L-1组。造成以上结果的主要原因可能与酪醇浓度有关，当酪醇浓度为1 mmol·L-1时，酪醇对细胞毒性小，不影响细胞生长，但也对细胞中酶的活性刺激小，导致红景天苷总产量偏低。当添加7 mmol·L-1酪醇时，虽然红景天苷产量有所提升，但对细胞毒性较大，导致细胞生长状况不好，最终红景天苷总产量也不高。处于中间浓度的3 mmol·L-1组，既能较好刺激细胞中负责酪醇糖基化的酶，同时又对细胞生长不产生太大的抑制作用，故3 mmol·L-1的酪醇浓度是益母草悬浮细胞系产红景天苷的最佳浓度。

2.2.2 益母草悬浮细胞系的红景天苷转化率受转化时间影响

转化时间是影响益母草悬浮细胞系产红景天苷的一个重要因素，当转化时间为48 h时，红景天苷的总转化率可达63%，而且在转化前期红景天苷总转化率、胞内胞外转化率都比较低，中期红景天苷总转化率、胞内转化率逐渐升高，后期红景天苷总转化率和胞内转化率下降、胞外转化率明显上升，如图7所示。出现以上实验结果的原因在于，前期细胞处于生长的延缓期，细胞生长缓慢、活性相对较低，故吸收酪醇的速度较慢，转化也比较低；中期细胞生长快、活性高，鲜重增加，酪醇几乎完全被吸收，因此胞内转化率明显增加；后期一方面生成的红景天苷被进一步代谢转化，另一方面部分细胞由于酪醇的长期毒害，致使自身破碎死亡，于是红景天苷释放胞外，造成胞外转化率上升，以及胞内转化率和总转化率的下降。

图6 不同酪醇浓度对益母草悬浮细胞系红景天苷总产量和细胞鲜重的影响

图7 转化时间对益母草悬浮细胞系红景天苷总转化率的影响

3 讨论

红景天苷是酪醇的葡萄糖苷，其生物合成的最后一步是在植物体内，由糖基转移酶将尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的葡萄糖基转移至酪醇上[16]。糖基转移酶(glycosyltransferase，EC 2.4.x.y)普遍存在于植物中，能通过合成糖苷键实现糖基的转移，而且如果糖基供体为UDPG，则称之为葡萄糖基转移酶(UGTs)。UGTs在植物体内催化生成的产物多是与植物次生代谢相关的物质[17]，例如本研究中红景天苷便是UGTs合成的一种次生代谢产物。

益母草在自然生长条件下不含红景天苷，这与益母草细胞无法自身生产酪醇有关。当向益母草植株外源性添加酪醇，并培养一段时间后，其叶片可检出酪醇和红景天苷的存在，这说明益母草可通过根系或叶片将酪醇吸收至细胞内，并利用自身含有的UGTs转化酪醇生成红景天苷。酪醇是酚类化合物，对植物生长有一定的毒害作用，因而植物通过糖基化，可降低酪醇对自身的影响[18]，但酪醇浓度超过一定限度后，会造成不可逆损伤，例如益母草出现根系腐烂、叶片发黑等现象。在本研究中，通过对酪醇转化条件和施加方式的考察，发现采用以喷洒0.5%酪醇溶液为主，再辅之以低浓度酪醇(<2 mmol·L-1)水培液的方式，可取得较好的转化效果，究其原因在于此种施加方式益母草受到的毒害较小，对酪醇利用率较高，转化合成红景天苷含量较高，而且可根据需要进行多次喷洒，以提高红景天苷在益母草体内的积累量。总之，利用益母草本身具有的UGTs，通过添加外源性酪醇，然后在体内转化合成红景天苷，可成为红景天苷生产的一条全新途径。

益母草悬浮细胞系转化酪醇生成红景天苷，是以益母草水培实验结果为基础开展的。通过此项实验，进一步验证了益母草细胞含有转化酪醇生成红景天苷的UGTs。同时，比较2项实验结果，还可看到益母草悬浮细胞系在产红景天苷上具有以下2方面的优势：时间优势，益母草从种子萌芽到植株长成需较长的水培周期，而益母草悬浮细胞系一旦建成，便可对细胞进行不间断地继代培养，甚至是冷冻保存，当再次需要进行转化合成时，又可在短时间内活化，因而能有效缩短红景天苷的生产周期。此外，益母草植株从外界吸收酪醇到产生红景天苷需1 d左右时间，而益母草悬浮细胞系则只需几个小时，这也说明益母草悬浮细胞系较益母草水培植株，在生成红景天苷上具有较大的时间优势；空间优势，一株益母草的水培需要较大空间来容纳水培相关设备，如水培箱、通气泵等，而一瓶益母草悬浮细胞则不需要太大空间，因而采用悬浮细胞的培养方式，可实现有限的生产空间最大化的生产目标产物。综合以上分析，益母草悬浮细胞系是比水培方式更加适合益母草大规模生产红景天苷的新方式。

益母草作为一种草本中药材，具有活血调经、利尿消肿、清热解毒等作用，常用于月经不调、痛经经闭、恶露不尽、水肿尿少、疮疡肿毒等病症[19]。在本研究中通过水培或悬浮细胞培养，使其含有了新物质红景天苷。该物质的抗疲劳、抗缺氧、抗炎、增强免疫力等功效，在一定程度上有助于益母草发挥其原有的药效，达到更好的治疗效果，因而后续有待进一步对含红景天苷的益母草或悬浮细胞进行相关研究，从而为益母草生产红景天苷，以及开发益母草相关的医药保健产品奠定理论基础。