改良清肺颗粒的稳定性研究

薛沾枚， 张 艳， 刘雪松， 郝敬友， 苏 景， 唐 伟，刘彦凯， 孙洪杰， 徐 丽， 张 备， 史同瑞*

（1.黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院，黑龙江齐齐哈尔 161005；2.哈尔滨绿达生动物药业有限公司，黑龙江哈尔滨 150039；3.黑龙江省动物疫病控制中心，黑龙江哈尔滨 150069）

呼吸系统疾病能够引起畜禽机体免疫力低下继而容易触发其他传染病的发生，常伴有咳嗽、气喘、呼气困难等症状，重则导致死亡，患病动物生产性能下降、养殖成本增高、经济效益减少（孟贤蕾，2020）。治疗畜禽由细菌感染所引发的呼吸系统疾病时，常使用抗生素，但易产生抗生素耐药性并造成动物体内药物残留；病毒性呼吸系统疾病常以预防为主，但常伴随细菌和寄生虫等的继发感染，提升高发病率和高死亡率（朱明霞，2016）。因此，开发具有抗呼吸道病原、副作用小的中草药替代品具有重要的意义（王玉芳，2016）。改良清肺颗粒方剂是由板蓝根、浙贝母、甘草、葶苈子、桔梗组成，经发酵、水提煎煮、浓缩、干燥制粒等工艺而成，具有化痰止咳的功效。颗粒剂便于用药，能够最大的发挥药效（Zhang，2021）。为保证药物在生产、贮存、运输中的质量，控制颗粒剂的稳定性是控制质量的重要部分，不仅能保留方剂中药物有效成分使其充分发挥药物疗效，又能确保临床应用的疗效性（刘锦泉，2012）。本试验对湿法制粒而成的改良清肺颗粒进行稳定性试验，为其在生产、运输、贮藏及使用上提供理论支持和科学参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验药物及试剂 改良清肺颗粒，以板蓝根、浙贝母、甘草、葶苈子、桔梗为处方（批号分别为20200415，20200416，20200417），由哈尔滨绿达生动物药业有限公司研制；槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷 （批号：20083104），购自成都普菲德生物技术有限公司；石油醚、乙酸乙酯，购自北京迪科马科技有限公司；甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯，水为超纯水。

1.1.2 试验仪器 高效液相色谱仪（LC-20AT，RF-20A）、InertSustain C18色谱柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm），购自岛津（中国）有限公司；漩涡振荡器（VortexQL902），购自海门市其林贝尔仪器制造有限公司；电子分析天平（MS104TS/02），购自梅特勒-托利多（上海）有限公司；隔膜真空泵（GM-0.33A），购自天津市津腾实验设备有限公司；电热恒温鼓风干燥箱，购自上海旭冠电子科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 薄层色谱鉴别 取改良清肺颗粒1 g，加入70%甲醇20 mL，加热回流1 h，滤过，滤液作为供试品溶液。取改良清肺颗粒阴性样品颗粒，制备方法同上。取葶苈子对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。再取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷对照品，加甲醇制成1 mL含0.5 mg的溶液作为对照品溶液。再吸取上述溶液5 μL，点于聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯:甲醇:水（7:2:1）为展开剂，2%三氯化铝为显色剂，热风吹干，置于365 nm紫外灯下观察。

1.2.2 槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量测定

1.2.2.1 色谱条件 色谱柱为InertSustain C18，流动相为甲醇∶0.02%磷酸＝7∶93， 流速为1.0 mL/min，柱温为25℃，检测波长为245 nm，进样量为10 μL。

1.2.2.2 对照品溶液制备 精密称取2 mg槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷对照品，放入50 mL容量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度，充分摇匀，制备成浓度为40 μg/mL的对照品溶液。

1.2.2.3 供试品溶液制备 称取适量颗粒剂样品，甲醇溶解，超声处理30 min，10000 r/min离心6 min，取上清液，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

1.2.2.4 线性关系考察 精密称取对照品溶液移置容量瓶中，甲醇定容，制成1 mL含对照品2.5、5、10、20、40 μg的溶液，上样量10 μL，在上述色谱条件下测定峰面积，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.2.5 精密度试验 精密量取对照品配制浓度为40 μg/mL的溶液，上样量10 μL，在上述色谱条件下测定峰面积，连续上样6次，计算相对标准标准差（RSD）。

1.2.2.6 稳定性试验 取同一份供试品溶液，在上述色谱条件下，分别间隔2 h进样，共测定12个时间点，测定峰面积，计算RSD值。

1.2.2.7 重复性试验 取同一批供试品溶液，连续制备6份，在上述色谱条件下，测定槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷平均含量，计算RSD值。

1.2.2.8 加样回收率试验 精密称取己知含量提取液，共6份，分别精密加入槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷对照品适量，分别进样l0 μL，计算样品的加样回收率。

1.2.3 水分检测 根据2020版《中国兽药典》（四部）通则0832水分检测法中烘干法测定水分，颗粒剂水分规≤8%（中国兽药典委员会，2020）。

1.2.4 粒度检测 根据2020版《中国兽药典》（四部）通则0982粒度检测法中双筛法测定粒度，颗粒剂粒度项下规定≤15%。

1.2.5 溶化性检测 根据2020版 《中国兽药典》（四部）通则0104检测溶化性，颗粒剂溶化性项下规定以颗粒剂5 min内全部溶化，肉眼观察无杂质无异物为符合标准。

1.2.6 影响因素试验

1.2.6.1 光照试验 随机选取3个不同批次的改良清肺颗粒成品，去除包装，适量均等称取，平铺置于培养皿内密闭容器中，将稳定性检测箱光源强度设置为（4500±500）lx，于第0、5、10天同一时间段，根据2020年版《中国兽药典》颗粒剂项检查。

1.2.6.2 高温试验 随机选取3个不同批次的改良清肺颗粒成品，去除包装，适量均等称取，平铺置于培养皿内密闭容器中，置于60℃环境下，于第0、5、10天同一时间段，根据2020年版《中国兽药典》颗粒剂项检查。

1.2.6.3 高湿试验 随机选取3个不同批次的改良清肺颗粒成品，去除包装，适量均等称取，平铺置于培养皿内密闭容器中，放置在NaCl饱和液饱和的干燥器中（湿度为74%），于第0、5、10天同一时间段，根据2020年版《中国兽药典》颗粒剂项检查。

1.2.7 加速稳定性试验 随机选取将3批不同批次的改良清肺颗粒成品，装入铝箔袋，密封包装，放置于温度为40℃，湿度为（75±5）%的恒温培养箱中， 放置6个月， 分别于第0、1、2、3、6个月取样，根据2020版《中国兽药典》颗粒剂项下要求检测性状、鉴别、粒度、水分、溶化性和槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量。第0个月之后取样与其进行对比检测。

1.2.8 长期稳定性试验 将3批不同批次的改良清肺颗粒成品，装入铝箔袋，密封包装，放置于温度为（25±2）℃，相对湿度为（60±10）%的条件下，放置12个月，每个月相同时间取样，根据2015版《中国兽药典》颗粒剂项下检测性状、鉴别、粒度、水分、溶化性和槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量情况。第0个月之后取样与其进行对比检测。

1.3 统计与分析 用Graphpad Prism 6.0软件进行统计分析，通过单因素方差进行差异显著性检验。结果以“平均数±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 薄层色谱 置紫外灯（254 nm）下视检。供试品色谱中与槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷对照品和南葶苈子对照药材色谱位置相同，显相同的浅紫红色斑点，阴性对照无干扰。详细结果见图1。

图1 改良清肺颗粒薄层色谱图

2.2 方法学研究

2.2.1 线性关系考察 经测定得槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷对照品标准曲线为y＝22074x-33975（R2＝0.9999），结果表明，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量在2.5～40 μg/mL内线性关系良好（图2、图3）。

图2 槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷标准曲线

图3 槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷标准品液相色谱图

2.2.2 精密度考察 连续6次进样，记录峰面积。槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷对照品峰面积的RSD为0.74%，结果表明，建立测定方法的精密度良好。

2.2.3 稳定性考察 在24 h内连续进样测定，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量RSD为0.65%，表明供试品溶液在室温条件下，24 h内稳定性良好。

2.2.4 重复性考察 重复测定的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷平均含量为4.50 mg/L，RSD为0.69%，表明测定方法的重复性良好。

2.2.5 加样回收率考察 结果见表1，平均回收率为98.53%，RSD为0.50%（n＝6），表明方法的准确性良好。

表1 槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷加样回收率试验结果

2.3 影响因素试验结果

2.3.1 光照对改良清肺颗粒稳定性影响 将改良清肺颗粒放置在（4500±500）lx光照强度下照射，于第5、10天后经肉眼观察外观性状未发现明显变化，颜色为棕黄色，经口味苦。放置第5天和第10天后水分及粒度检测无明显变化，较第0天相比水分有所增加但符合规定。放置第5、10天后取样槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量无明显变化（P＞0.05），结果表明光照环境对改良清肺颗粒的性状、水分、粒度、溶化性、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量影响不明显（表2）。

表2 光照对改良清肺颗粒稳定性的影响结果（n=3）

2.3.2 高温对改良清肺颗粒稳定性影响 将改良清肺颗粒放置在60℃环境下，于第5天后经肉眼观察外观性状未发现明显变化，颜色为棕黄色，经口味苦，10 d后观察颜色较之前比颜色偏浅，经口味苦。随着时间增加第10天后与最初相比水分减少0.52%（P＜0.05），粒度无明显变化，颗粒剂中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量降低9%（P＜0.05）（表3）。

表3 高温对改良清肺颗粒稳定性的影响结果（n=3）

2.3.3 高湿对改良清肺颗粒稳定性影响 将改良清肺颗粒放置在NaCl饱和液饱和的干燥器中（湿度为74%），于第5天经观察外观性状未发生明显变化，颜色为棕黄色，经口味苦。放置第10天后颜色变深为棕褐色，经口味苦。随着时间的增加放置第5天与第0天相比水分含量、粒度及槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量差异显著，水分提高5.23%，含量降低0.9%（P＜0.05）；第10天后水分与第0天相比水分提高19.37%（P＜0.01），粒度和槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量分别降低9.3%和3%（P＜0.05），溶化性较第0天相比逐渐变差但符合规定。结果表明高湿环境对改良清肺颗粒的水分含量影响极大，对粒度和颗粒剂中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量有显著影响，对溶化性影响不明显（表4）。

表4 高湿对改良清肺颗粒稳定性的影响结果（n=3）

2.4 加速试验结果 将改良清肺颗粒在温度为（40±2）℃，湿度为（75±5）%环境中放置6个月，于第1、2、3、4、5、6月后取样检测，外观观察颗粒剂颜色、水分含量、粒度、溶化性、含量均未发生明显变化，各项指标均符合规定，表明颗粒剂稳定性良好。

2.5 长期试验结果 将改良清肺颗粒放置室温贮存12个月，于每个月同一时间取样检测，外观观察颜色无明显变化，颜色为棕黄色味苦，水分含量、粒度、溶化性、含量均未发生明显变化，各项指标均符合规定，表明颗粒剂稳定性良好。

3 讨论

3.1 改良清肺颗粒的含量测定 中草药颗粒剂为中草药汤剂基础上发展起来的常用中草药剂型，其优点是便于携带、运输、贮藏（郭静，2020）。中草药提取物的成分复杂，大多数为亲水成分，因此稳定性研究是颗粒剂研发与生产中的关键部分（曾春姣，2019）。中草药颗粒剂如果贮藏不当会发生吸潮、沉淀、变质等现象，对药物的有效成分及含量造成影响，导致药物极易失效，从而产生毒副作用影响临床应用效果（谢平，2020）。中草药颗粒剂质量可控是中草药制剂研究的根本要求，但通常存在药物不稳定性的问题，这也是限制中草药制剂发展的主要原因之一（郎吉瑞，2020）。本试验根据 “兽用中药、天然药物制剂研究技术指导原则”对改良清肺颗粒的有效含量进行研究，改良清肺颗粒为中成药，由板蓝根、浙贝母、甘草、葶苈子、桔梗5味药组成，葶苈子为清肺处方药剂中的“君药”，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷为葶苈子提取物中主要有效成分之一，含量高，具有专属性。为保证改良清肺颗粒药物稳定性，本试验选取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷的含量进行检测 （刘冬菊，2020；李玉平，2012）。

3.2 环境对改良清肺颗粒稳定性的影响 影响因素试验能够检测出对颗粒剂药物稳定性影响的环境条件，使药物能够更合理的贮存及包装。万寿菊颗粒稳定性研究结果表明在储存中应避免高温、光照、碱、酸（杨云裳，2009）。本研究选取光照、高温、高湿三种因素进行颗粒剂稳定性考察 （李玥，2019）。结果表明，高湿是影响改良清肺颗粒的重要因素，将改良清肺颗粒放置在湿度75%的环境下，放置5 d和10 d后，经检查水分含量均超过了8%，粒度超过了15%，可见湿度对颗粒的稳定性影响较大，因此改良清肺颗粒适宜在低湿度环境中保存（周晓霞，2011）。

3.3 时间对改良清肺颗粒稳定性的影响 为研究改良清肺颗粒的长期贮存的稳定性及适宜保存期，对改良清肺颗粒进行加速试验和长期试验（周晓霞，2011）。在为期6个月的加速试验中，外观颜色始终为棕黄色，颗粒流动性良好，经检测水分含量、粒度、溶化性均符合2015版《中国药典》颗粒剂项标准，改良清肺颗粒中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量未发生明显变化，表明改良清肺颗粒的稳定性良好。在为期12个月的长期试验中，每间隔一个月进行检测，颗粒剂的流动性相比较好，未发现颗粒剂有凝结粘连现象，水分含量未发生明显增加，粒度、溶化性良好，颗粒剂中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量未发生明显变化 （杜宇，2019）。因此，贮存时间对改良清肺颗粒稳定性影响较小（刘广义，2019）。

4 结论

改良清肺颗粒是颜色为棕黄色，经口味苦的固体颗粒剂，颗粒剂中药物含量稳定，水分含量、粒度、溶化性均符合2015版《中国药典》，室温贮存12个月未见明显变化，但在贮存过程中应注意避免高湿对改良清肺颗粒稳定性的影响。