大孔树脂纯化蓝刺头中总黄酮生产工艺探讨

罗爱勤， 曹颖男， 钟春燕

（广州新华学院，广东广州 510520）

蓝刺头是菊科植物蓝刺头 （Echinops Latifolius Tausch.）的干燥头状花序，被列入卫生部蒙药分册中，有苦、稀、轻、软、钝、凉等药性（国家药典委员会，1998）。张勇等（2018）和巴音额古乐等（2015）研究证实，蓝刺头可以稳固骨骼、接骨愈伤、退热止痛，用于治疗骨折、骨热、刺痛、疮疡等症。刘岩等（2017）研究表明，蓝刺头可以降低血清骨钙素（BGP）水平，因其具有类雌激素样活性作用，能上调去卵巢大鼠ERα和ERβ的表达，从而促进骨骼形成，调节骨骼吸收与骨形成的偶联，降低骨转化速率，减小骨缺失，可有效防治绝经后骨质疏松症。王佳琪等（2018）研究蓝刺头等化学成分，并从中分离得黄酮类化合物，谢友良等（2019）对蓝刺头化学成分的相关研究进行了综述，表明其主要黄酮类化合物为芹菜素及其苷。芹菜素具有明显的雌激素样活性作用，巴音额古乐等（2015）、寇咏梅（2013）和朱瑞清（2012）研究表明，芹菜素发挥雌激素样活性作用的信号通路与雌激素活性信号通路不完全一样，B环位置是雌激素样活性作用的一个重要位点。因此，总黄酮、芹菜素及其苷是蓝刺头中重要的药理活性成分，本文研究了蓝刺头中总黄酮的富集工艺过程，旨在为药用植物蓝刺头的开发应用和产业化奠定试验基础。此外，蓝刺头在内蒙也作为畜牧料草使用，对蓝刺头的深入研究也能促进当地的农牧业发展。

1 仪器和材料

1.1 仪器BS210S电子天平 （德国Sartorius）、UV-2550紫外分光光度计（岛津）、KQ-400GKDV超声波清洗机（昆山市超声波设备有限公司）

1.2 材料 芹菜苷标准品 （≥98.0%，批号C12209806，质量分数98%，上海铭博生物科技有限公司），蓝刺头药材（保定仙德中药销售公司，批号100210301，经广州新华学院药学院鉴定系菊科植物蓝刺头的干燥头状花序），大孔树脂D101、AB-8、X-5、HPD-400、NKA-9（天津南大树脂科技有限公司），其他试剂（分析纯），纯化水。

2 方法和结果

2.1 紫外-可见分光光度法测定总黄酮

2.1.1 标准溶液的制备 取适量芹菜苷标准品，精密称定，装入10 mL量瓶中，加入60%乙醇，制成每毫升含有芹菜苷0.328 mg的溶液，即得。

2.1.2 标准曲线的制备 精密吸取芹菜苷标准溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL， 分 别 装 入10 mL量瓶中，加入5%三氯化铝溶液3 mL，然后加入60%乙醇至刻度，充分摇动后静置30 min。采用紫外-可见分光光度法测定（中国药典2020年版四部通则0401），在波长275 nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线（国家药典委员会，2020）。所得回归方程为Y＝0.0357X-0.0065，r＝0.99994。 结果显示，芹菜苷标准品在3.28～32.8 μg/mL与吸光度值呈良好的线性关系。

2.1.3 测定法 精密吸取样品溶液1.0 mL，装入10 mL测量瓶中，加入5%三氯化铝溶液3 mL，再加入60%乙醇至刻度，充分振荡后放置30 min。按照标准曲线的制备方法，依法测量吸光度，从标准曲线中读出样品溶液中所包含的芹菜苷量（μg），计算，即得。

2.2 上样液的制备 取适量蓝刺头（粉碎），用10倍55%乙醇回流提取2次，每次1 h，合并55%乙醇提取液，回收乙醇并浓缩至适量，加水使稀释至药材量的10倍，于4000 r/min离心分离10 min，取出上清液，即得。

2.3 大孔树脂的预处理 按照兰海等 （2020）的试验方法，将大孔吸附树脂用水浸泡3次，20 min/次，过滤，用乙醇煮沸30 min，过滤，再用乙醇浸泡24 h，备用。

2.4 树脂型号筛选 利用静态吸附试验，确定大孔树脂的比吸附量和解吸量，筛选出最佳树脂类型。 取D101、AB-8、X-5、HPD-400和NKA-9大孔树脂进行预处理，称取2 g处理后的树脂分别装入不同锥形瓶中，加入50 mL样品溶液（含总黄酮5 mg/mL），静态吸附24 h，吸附平衡后，过滤，向吸附溶液中加水至50 mL，测定溶液中总黄酮量，计算吸附量（吸附量＝样品溶液总黄酮量-吸附后溶液中总黄酮量）和比吸附量（比吸附量＝吸附量/树脂量），结果如表1所示。

表1 大孔树脂对蓝刺头溶液中总黄酮的静态吸附

取吸附后的树脂，用纯化水浸泡2次（100 mL、30 min/次），滤干，向树脂中加入100 mL 80%乙醇，静态吸附24 h，过滤，取滤液，加入80%乙醇，定容为100 mL，测定80%乙醇溶液中总黄酮量（即解吸量），计算比解吸量（比解吸量＝解吸量/树脂量）和解吸率（解吸率＝解吸量/吸附量），结果见表2。

新生儿气胸常并发新生儿湿肺、新生儿肺炎、新生儿吸入综合征，严重影响新生儿生活质量。因此，及时诊断并治疗新生儿气胸对改善其预后有着较为重要的作用[3-4]。

表2 吸附后大孔树脂对蓝刺头总黄酮的静态解吸

从表1和表2结果中可以清楚地看出，不同极性的大孔树脂对蓝刺头总黄酮具有一定的吸附作用，其中，D101、AB-8和X-5大孔树脂对蓝刺头总黄酮的吸附作用明显强于HPD-400和NKA-9大孔树脂，AB-8大孔树脂的吸附性能最佳。D101大孔树脂的解吸能力较其他类型的树脂要弱，其他大孔树脂可以完全解吸蓝刺头总黄酮。因此，综合考虑吸附和解吸，选择AB-8大孔树脂进行下一步研究。

2.5 动态吸附试验研究

2.5.1 蓝刺头上样液浓度对大孔树脂比吸附量的影响 按2.2.1项下方法，制备总黄酮含量为3.01、4.23、5.17、6.04、7.18 mg/mL的蓝刺头上样液各300 mL，取AB-8大孔树脂进行预处理后分成5份，每份15.50 g，分别加入上述上样液中，然后进行静态吸附，分别于静态吸附1、2、3、4、5、6、7、8、10 h后取样，测定取样液中总黄酮量，结果见表3。

表3 蓝刺头上样液浓度对AB-8大孔树脂比吸附量的影响

从表3中可以看出，随着吸附时间的延长，AB-8大孔树脂对不同浓度蓝刺头上样液的比吸附量逐渐增加；大孔树脂吸附1 h后对初始含量为6.04 mg/mL的蓝刺头上样液的比吸附量要比其他浓度上样液的高，但吸附时间大于1 h后，树脂对该浓度上样液的比吸附量的增加幅度小于其他浓度上样液，表明AB-8大孔树脂可以在短时间内从初始含量为6.04 mg/mL的蓝刺头上样液中吸附总黄酮，达到基本饱和。

2.5.2 最大上样体积的考察 将AB-8大孔树脂进行预处理，称取12.5 g湿法装柱（φ=1cm径高比1：8），取总黄酮量6.04 mg/mL的蓝刺头上样液200 mL加入树脂柱中，收集流出液（10 mL/管），分别检测累积流出液中总黄酮量，结果见表4。

表4 累积流出液中总黄酮含量测定结果

由表4可知，累积流出液达到150 mL以上时，从流出液中检测出总黄酮，表明有总黄酮泄露，累积体积157 mL为总黄酮含量的拐点，因此对总黄酮含量为6.04 mg/mL的蓝刺头上样液，其上样体积不宜超过150 mL。

2.5.3 上样液吸附速度对树脂比吸附量的影响取AB-8大孔树脂进行预处理，称量9.65 g湿法装柱，再取总黄酮含量6.04 mg/mL的蓝刺头上样液300 mL， 分别以每小时0.5、1、1.5、2、2.5倍树脂柱体积的速度进行动态吸附，然后用纯化水以2 BV/h的速度进行清洗除杂，收集流出液，测定流出液中总黄酮量，计算树脂比吸附量，结果见表5。

表5 上样速度对比吸附量的影响

由表5结果可看出，在0.5 BV/h和1.0 BV/h上样吸附速度下，AB-8大孔树脂对上样液的比吸附量高于其他速度，而0.5 BV/h和1.0 BV/h的上样速度下，树脂的比吸附量没有明显差异，但是上样速度慢，吸附时间长。

图1 不同径高比AB-8大孔吸附树脂对蓝刺头总黄酮的动态吸附和解吸效果比较

2.6 响应面优化试验设计

2.6.1 试验结果 根据动态吸附试验研究结果，设计3因素3水平（表6），运用Box-Behnken中心组合设计的基本原理，按照张沛等（2021）和牛鹤丽（2021）的试验方法，进行了RSM分析试验，按表8分别使用AB-8大孔树脂动态吸附蓝刺头上样液后，以纯化水4 BV进行除杂（2 BV/h），然后用80%乙醇4 BV进行洗脱 （1 BV/h），接收80%乙醇洗脱液，回收溶剂并干燥得干膏，测定干膏中总黄酮的含量，以考察上样液浓度（A）、上样速度（B）和树脂径高比（C）对纯化后所得干膏中总黄酮含量（Y）的影响，结果见表7。

表6 Box-behnken试验设计因素水平

表7 响应面试验结果

2.6.2 响应曲面方差分析 通过多元回归对上述试验结果的参数进行了模拟，以总黄酮含量为目标函数，得出了各参数水平的多元二次方程：Y＝65.90+0.0875A+0.3375B-0.275C-0.6AB-0.325AC-0.075BC-4.23A2-2.38B2-2.40C2，对此进行显著性检验和方差分析，结果如表8所示。

表8 响应面方差分析

从表8中可以看出，该回归模型P＜0.01表示二次回归方程的模型显著，失拟项P＝0.0716＞0.05表示该回归方程的拟合度高，误差对试验结果影响较小，模型可靠，R2＝0.9745表明模型可充分拟合试验数据，与邓佑林等（2021）的试验结果一致。在所有影响因子中，仅二次项A2、B2、C2对总黄酮含量的变化影响极显著 （P＜0.01）。从表中F值可知，各因素对总黄酮纯化影响大小顺序为：上样速度（B）＞树脂径高比（C）＞上样液浓度（A）。

2.6.3 两因素间的交互作用 不同因素相互作用影响总黄酮含量的响应曲面如图2所示。李慧敏等（2018）的研究表明，曲面越陡，表示该因素对总黄酮含量的影响越大。从图2可以清晰地看出，总黄酮含量的三个响应曲面均开口朝下，与三个影响因子均有明显的二次抛物关系，上样液浓度、上样液吸附速度和树脂径高比不断增加，总黄酮含量逐渐升高，并出现极大值，随后呈不同斜率的下降，另从方差分析结果与响应曲面观察可知，AB曲线变化最为密集陡峭，其次为AC，影响最小为BC。对二次抛物线函数模型进行了极值分析，得到的AB-8大孔树脂纯化蓝刺头总黄酮的最优工艺条件为：蓝刺头上样液总黄酮量6 mg/mL，树脂径高比1：8，上样液吸附速度1 BV/h，洗脱溶剂80%乙醇，纯化后总黄酮理论含量为63.9%，实际含量达65%以上，与模型预测值较接近。

图2 两因素交互影响总黄酮含量的响应曲面

2.7 乙醇洗脱液浓度的考察 将AB-8大孔树脂进行预处理，称取3份（10 g/份），湿法装柱（φ＝1 cm径高比1：8），再取6.04 mg/mL蓝刺头上样液3份（150 mL/份），分别动态吸附（1 BV/h），接着用纯化水4 BV除杂 （2 BV/h），然后分别使用70%、80%、95%乙醇4 BV洗脱（1 BV/h），分别接收水洗液和各浓度乙醇洗脱液，测定其中总黄酮，计算吸附量、比解吸量和解吸率，将各浓度乙醇洗脱液浓缩并干燥得干膏，称量干膏重，并测定干膏中总黄酮含量，结果如表9所示。

表9 不同浓度乙醇溶液的洗脱情况

从表10结果可知，80%和95%乙醇均能将树脂所吸附的总黄酮完全解吸，但是95%乙醇洗脱所得的干膏纯度较低。

2.8 验证试验 取已处理的AB-8大孔树脂3份（10 g/份），湿法装柱（φ＝1 cm径高比1：8），再取6.04 mg/mL蓝刺头上样液3份（150 mL/份），分别动态吸附（1 BV/h），接着用纯化水4 BV除杂（2 BV/h），然后用80%乙醇4 BV洗脱（1 BV/h），接收水洗液和80%乙醇洗脱液，测定其中总黄酮，计算吸附量、比解吸量和解吸率，将80%乙醇洗脱液经过浓缩后进行蒸干，得到干膏，称量干膏重量，测定干膏中总黄酮含量，结果如表10所示。从表10结果可知，该工艺条件纯化所得的蓝刺头总黄酮含量达65%以上，且工艺重复性良好。

表10 验证试验结果

3 讨论

本试验中在芹菜苷对照品溶液中加入亚硝酸钠、硝酸铝和氢氧化钠试剂，结果无红色物质产生，在500 nm处也无吸收，说明亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法并不适用蓝刺头总黄酮的测定。李莲芳等（2017）利用结构中含5-羟基、4-羰基的黄酮类化合物能与三氯化铝反应形成络合物的原理来测定大枣中总黄酮的含量；芹菜苷结构中也含相同结构，能使带I或带II向红位移；带II红移后对照品溶液与供试品溶液在（275±2）nm处有共同吸收峰，因而可以用三氯化铝作为显色剂测定蓝刺头总黄酮的含量。目前，已有较多文献报道采用三氯化铝比色法测定植物中的总黄酮含量（孟宪琦等，2021；黄艳萍等，2021；张国权等，2018；刘云鹤等，2017），主要因为三氯化铝显色法测定总黄酮结果在误差范围内准确度较高，显色反应时黄酮类物质反应较强，而对色素、酚酸等非黄酮类物质的反应极弱，因而对黄酮类化合物的专属性较强。本研究中利用三氯化铝与5-羟基、4-羰基的黄酮或黄酮醇类化合物反应生成络合物使带II向红位移的原理测定蓝刺头总黄酮的含量，测定法经方法学验证重复性、精密度、稳定性和准确度较好。

大孔树脂已被广泛使用，主要用于进行自然界化合物的分离、富集，如糖苷及其他糖类的分离，在多糖、黄酮类、三萜类和生物碱等化合物的分离精制中，存在着许多的应用案例。蓝刺头中的总黄酮如芹菜素、芹菜苷，其结构中主要含有5，3’-二羟基，易被大孔树脂直接吸附，不能直接用水洗脱，只能用一定浓度的乙醇溶液洗脱。因此，纯化蓝刺头总黄酮时，可以用纯化水去除一些高极性杂质，如糖、蛋白和黏液质，以无色洗脱液为终点，判断洗脱去除杂质的效果。水洗后用高浓度乙醇为洗脱剂，收集所要富集的总黄酮类成分。

本研究共选取了5种不同类型的大孔树脂，分别考察了它们的吸附性能和解吸特性，选取了性能最佳的AB-8大孔树脂用于蓝刺头总黄酮的纯化。此外，研究过程中考察了蓝刺头上样液的浓度及其最大上样体积、上样液吸附的速度和树脂径高比等因素对树脂吸附蓝刺头总黄酮能力的影响，以及总黄酮纯化效果的影响，并筛选出最佳工艺条件。利用最佳工艺纯化后的蓝刺头总黄酮的含量超过65%，表明纯化效果良好，本研究为蓝刺头的进一步开发和应用奠定了基础。