小米多糖的提取及抑菌作用研究

赵建英，张森虎，李艳松，李 详，白 建

（吕梁学院生命科学系，山西吕梁 033001）

小米有很高的营养价值，常被用来制作各种养生粥，还可以用来发酵酿酒，因此对小米多糖的工艺提取可以开发出新的营养丰富且健康的食品（Yang等，2021）。 高晶晶等（2020）研究表明，小米多糖具有一定的抗氧化性，其质量浓度与抗氧化性成正比。王玺等（2016）研究表明，多糖提取率与液固比成正相关，增大液固比，多糖能够有效的融到溶液中，提高多糖提取率。刘丹丹等（2019）研究表明，多糖可以抑制细菌的生长，对革兰氏染色为紫色的抑菌效果最好。宋乐园（2020）通过对红小米多糖提取研究后，得出了红小米多糖的最佳提取条件。路志芳等（2017）研究表明，植物多糖可以广泛应用于医疗行业和食品保健领域等，目前已经利用植物多糖研发出一些医疗药品，治疗病毒感染和肿瘤，改善人体的免疫功能，预防心血管疾病等，比如香菇多糖的应用。Wang等（2019）研究表明，原位葡聚糖生产改变了小米的营养价值，导致游离酚类含量和抗氧化活性增加。已有的研究发现HSP-3可作为功能性食品中的活性成分（Huo等，2020；Sharma等，2019）。

本研究以沁州小米为主要原料，按单因素试验，选出提取时间、提取温度、料液比三个因素进行响应面试验（高涛等，2020），确定小米多糖最佳提取条件。对提取出的小米多糖采用滤纸片法（Xu等，2020；Li等，2019）进行抑菌研究，测定其对供试菌的抑菌效果，确定最低抑菌浓度。并研究不同温度和pH对小米多糖抑菌能力的影响，为小米多糖的开发利用提供理论依据和实践参考。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂 沁州小米采购于吕梁星玛客超市，酒石酸钾钠、3，5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、苯酚、牛肉膏、氯化钠、蛋白胨、琼脂等均是分析纯，供试菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）由吕梁学院微生物实验室提供。

1.2 主要仪器HH系列数显恒温水浴锅：上海禾汽玻璃仪器有限公司；SC-04低速离心机：张家港市腾鹰机械制造有限公司；FA114A电子秤：广东豪晟科学仪器有限公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅：河南省泰斯特仪器有限公司；UV-1601紫外分光光度计：青岛聚创华业分析仪器有限公司；101-00AB恒温鼓风干燥箱：邢台钜都科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 小米预处理 将沁州小米置于60℃恒温干燥箱中，干燥40 min。

1.3.2 小米多糖提取 取5 g小米放入烧杯中，加入100 mL蒸馏水，将烧杯放入恒温水浴锅中，在80℃下浸提2 h，取出提取液用滤纸进行过滤，然后将滤液用低速离心机3900 r/min离心25 min，然后取上清液，加入60 mL 95%乙醇，再3900 r/min离心20 min，然后过滤，得到小米粗多糖（诸爱士等，2019），溶解沉淀并定容，取15 mL溶液与烧杯中，然后加盐酸溶液2 mL，置于60℃水浴锅中加热20 min，静置冷却，然后滴一滴酚酞试剂，用2 mL 2 mol/mL的氢氧化钠溶液滴定至淡红色，将溶液倒入50 mL容量瓶中，摇匀得到小米多糖溶液，用3，5二硝基-水杨酸法（王明瑞等，2020）检测多糖的含量，以此计算小米多糖提取率。

1.3.3 DNS试剂配制 称取3，5-二硝基水杨酸3.15 g，酒石酸钾钠91.0 g，苯酚2.50 g和无水亚硫酸钠2.50 g，采用詹梦涛等（2020）的方法配制DNS试剂。配制完成后，放置在棕色瓶中避光储存，室温下存放一周后使用。

1.3.4 葡萄糖标准曲线的绘制 根据罗春萍等（2021）的方法配制葡萄糖标准溶液。分别取葡萄糖 标 准 液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40 mL和1.60mL于5mL比色管中，用蒸馏水补至2.50mL，滴加DNS试剂2 mL，100℃加热10 min，然后静置冷却，在波长为540 nm处进行检测，读出吸光度值。绘制葡萄糖溶液的标准曲线。

1.3.5 小米多糖含量的测定 取2 mL小米多糖溶液于25 mL具塞试管中，加入2 mL DNS试剂，加热一段时间，然后静置冷却，加入10 mL蒸馏水，对照组用蒸馏水，然后在540 nm波长处进行检测，读出吸光度值，计算出小米多糖的提取率（张小贝等，2017）。小米多糖提取率的计算公式：φ＝（（ρ-V）×0.9）/m×100。

1.4 单因素试验 由预试验得到提取时间为2 h，提取温度为80℃，液料比为20：1，多糖提取率最高达3.27%。分别改变提取时间（1、1.5、2、2.5、3 h），提取温度（70、75、80、85、90℃），料液比（10：1、15：1、20：1、25：1、30：1），以此进行小米多糖的提取。

1.5 响应面优化试验 利用单因素试验得出的数据，进行BBD响应面法试验（张环宇等，2020），以提取时间（A）、提取温度（B）、料液比（C）作为三个影响因素，以小米多糖提取率为考察指标。响应面分析因素与水平见表1。

表1 响应面分析因素与水平

1.6 小米多糖抑菌试验

1.6.1 牛肉膏蛋白胨培养基的制作 采用汤强等（2018）的方法配制牛肉膏蛋白胨培养基，在无菌环境下操作。

1.6.2 菌悬液的制备 取10 mL的蒸馏水于试管中，用酒精灯加热，在酒精灯旁冷却后倒入接种管中，塞上棉塞，摇晃7～9次，然后倒入试管中，备用。

1.6.3 抑菌圈的测定 把滤纸用打孔器做成直径为6 mm大小的形状，在培养皿中加入5 mL过滤后的小米多糖提取液，充分浸泡1 h后，用酒精灯灼烧镊子，待冷却后用镊子将滤纸贴在培养基上，然后放在37℃培养箱中培养1 d。用无菌水为对照组，测量抑菌圈的直径大小，试验进行3次，取中间值（李世杰等，2018）。配制10 mg/mL的青霉素钠溶液为阳性对照（许海燕等，2020）。

1.6.4 小米多糖最低抑菌浓度的测定 用二倍肉汤稀释法（毛畅思等，2021）测定小米多糖提取液的最低抑菌浓度（MIC），小米多糖提取液用无菌水连续稀释最终质量浓度为0、0.1427、0.2854、0.5708、1.1416、2.2832、4.5664、9.1328 mg/mL， 在37℃恒温培养箱培育24～36 h后，当试管中没有菌落生长时，以测定最小抑菌浓度。

1.6.5 不同温度对小米多糖抑菌能力的影响 将提取出的小米多糖均分为5份，放入烧杯中，在恒温条件下将小米多糖提取液的温度调为20、50、80、100、130℃，并恒温加热30 min，以无菌水为对照组，然后用滤纸片法对3种供试菌的抑菌效果进行测定，平行3次试验（唐志凌等，2021；高晶晶等，2020）。

1.6.6 不同pH对小米多糖抑菌能力的影响 将提取出的小米多糖均分为5份，利用1 mol/L的盐酸和1 mol/L的氢氧化钠溶液将小米多糖提取液的pH调为1、4、7、10、13， 以无菌水为对照组，然后用滤纸片法对3种供试菌的抑菌效果进行测定，平行3次试验 （吴孔阳等，2021；刘永永等，2021；吴孔阳等，2020）。

1.7 数据处理 所有的基础数据都在Microsoft Excel 2010中归纳整理，单因素试验作图利用Graphpad Prism8.0，利用Design-ExPert 11软件对Box-Behnken（BBD）响应面试验进行分析，最后使用Adobe Photoshop CC 2021对所得的所有图片进行修饰。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线 由图1可知，标准曲线的线性回归方程为：Y＝0.6157X－0.0712，R2＝0.984。

图1 葡萄糖标准曲线

2.2 单因素试验结果与分析

2.2.1 提取时间对小米多糖提取率的影响 图2表明，在提取1～2 h时，小米提取率从1.26%增长到2.86%，提取时间增加后，提取率又开始降低。这是因为用热水浸提时，小米在一段时间后才能破坏细胞壁，而多糖要溶解在溶液中也需要一定的时间，一定时间浸提后，更多的多糖溶解到溶液中，而提取时间太长，会使的多糖在高温下发生糖酵解，稳定性降低，所以小米多糖最佳提取时间为2 h。

图2 提取时间对多糖提取率的影响

2.2.2 提取温度对小米多糖提取率的影响 由图3可以看出，在温度为70～80℃时，随着温度的升高，多糖提取率升高，在80℃后，多糖提取率下降，这是因为热处理可以破坏小米细胞，使多糖溶解在水中，温度升高会提高物质的扩散系数，加快溶解。在一定的时间内使多糖提取率增加，但过高的温度会使多糖变性，而使多糖提取率减少。因此，小米多糖的最佳提取温度为80℃。

图3 提取温度对多糖提取率的影响

2.2.3 料液比对小米多糖提取率的影响 从图4可以看出，料液比可改变溶液的浓度以及溶液黏度等，当料液比的比例变大时，溶液中多糖的浓度降低，多糖提取率增大。但当料液比的比例太大时，溶解速度过快，多糖提取变得困难，增加了损耗，导致多糖损失。由图4可以看出，当料液比增大时，多糖提取率快速增加，而料液比再变大后，多糖提取率反而降低。因此，当料液比为20：1时，小米多糖提取量最多。

图4 料液比对多糖提取率的影响

2.3 响应面优化结果

2.3.1 响应面试验结果分析 运用Design-Expert 11软件对表1和表2中的数据进行多元回归拟合，并进行模型优化，得到回归方程：Y＝3.04+0.1963A+0.0510B—0.0890C—0.0438AB+0.0413AC+0.0317BC-0.4989A2-0.2054B2-0.2919C2。

表2 试验设计和结果

对模型的显著性进行检验，由表3可知，响应面模型P＜0.0001，表明拟合检验极显著，失拟检验P＝0.9814＞0.05，表明失拟项不显著，这说明方程模拟比较好，可以用该模型进行预测。

由表3可以看出，相关系数R2＝0.9957，表明模型显著。校正系数R2Adj＝0.9901，说明该模型只有0.99%无法解释。两个差值小于0.2，说明具有一致性，模型与实际情况拟合很好。变异系数CV＝1.42%，模型可靠，可以较好地反映真实试验值，所选用的二次多项模型有效。

对模型的各系数显著性检验分析可知 （表3），因素A、B、C表现为极显著；交互项AB表现为显著，AC、BC表现为不显著， 二次线A2、B2、C2表现为极显著。该模型中的F值可以看出三个因素对多糖提取率都有非常显著的影响，其中A、B、C的值分别为230.03、15.53、47.31，所以可以得出A、B、C对多糖提取率的影响力由大到小为：提取时间＞料液比＞提取温度。

表3 回归模型方差分析

2.3.2 交互作用分析 由图5可知，因素A与因素B相互作用3D曲面弯折程度大，坡度较峭，且等高线为椭圆形，说明因素A与因素B之间的交互作用对小米多糖的提取率影响显著。从3D图可以看出，当因素A为2 h，因素B为80℃时小米多糖提取率最高，为3.051%。从等高线可以看出，因素B对小米多糖提取率的影响小于因素A，说明在因素A与因素B中，小米多糖提取率主要受因素A的影响。

图5 提取时间和提取温度对多糖提取率影响的响应面图和等高线图

由图6可知，因素A与因素C相互作用3D曲面弯折程度小，坡度较缓，且等高线近似为圆形，说明因素A与因素C之间的交互作用对小米多糖的提取率影响不显著。从3D图可以看出，当因素A为2 h，因素C为20：1时小米多糖提取率最高，为3.042%。从等高线可以看出，因素C对小米多糖提取率的影响小于因素A，说明在因素A与因素C中，小米多糖提取率主要受因素A的影响。

图6 提取时间和料液比对多糖提取率影响的响应面图和等高线图

由图7可知，因素B与因素C相互作用3D曲面弯折程度小，坡度较缓，且等高线近似为圆形，说明因素B与因素C之间的交互作用对小米多糖的提取率影响不显著。从3D图可以看出，当因素B为80℃，因素C为20：1时小米多糖提取率最高，达2.969%。从等高线可以看出，因素B对小米多糖提取率的影响小于因素C，说明在因素B与因素C中，小米多糖提取率主要受因素C的影响。

图7 提取温度和料液比对多糖提取率影响的响应面图和等高线图

2.4 验证试验 运用响应面设计软件对回归方程进行计算，将提取时间、提取温度、料液比的取值分别设定为1.5～2.5 h，75～85℃，15：1～25：1，并将目标值设定为最大值。获得的最佳提取条件为：提取时间2.11 h，提取温度80.6℃，料液比19.2：1。按此提取条件提取的小米多糖提取率为3.067%，根据实际操作情况将最优组合修改为提取时间2.1 h，温度80℃，料液比19：1，在此条件下平行3次试验。提取的小米多糖提取率为3.066%，与预测值接近，这说明回归模拟准确可用，利用响应面结合主成分分析法优化小米多糖的提取的方法准确可行。

2.5 小米多糖的抑菌能力

2.5.1 小米多糖对供试细菌的抑菌测定 由表4可知，小米多糖对供试菌都具有抑制作用。且相对于阳性对照组，小米多糖的抑菌效果更强，其中小米多糖对革兰氏阳性菌的抑菌效果最好，其抑菌直径可达（12.75±1.76）mm。小米多糖对革兰氏阴性菌的抑菌效果较弱，其抑菌圈直径为 （10.03±1.53）mm，小米多糖对枯草芽孢杆菌的抑制效果最弱，其抑菌圈直径为（8.77±0.79）mm。

表4 小米多糖对供试菌的抑菌效果 mm

2.5.2 小米多糖对供试菌的最低抑菌浓度 由表5可知，小米多糖提取液对三个供试菌的最小抑制浓度分别为1.1416、2.2832、4.5664 mg/mL， 小米多糖提取液对细菌的抑制作用随浓度的增大而增强。

表5 小米多糖对供试菌的最低抑菌浓度

2.5.3 不同温度下小米多糖对供试菌抑菌的测定从图8可以看出，温度的变化不会明显影响小米多糖的抑菌效果，即使120℃下处理小米多糖后，其仍然具有抑菌能力。但随着温度的升高，小米多糖的抑菌效果会稍微降低，这是由于高温破坏了小米多糖的结构。

图8 不同温度对供试菌抑菌的影响

2.5.4 不同pH下小米多糖对供试菌的测定 从图9可以看出，不同酸碱度条件下的小米多糖的抑制作用有所不同，pH越趋于中性，小米多糖的抑菌效果越佳，在pH为7时，小米多糖对大肠杆菌的抑制效果最佳。而在酸性或碱性条件下，小米多糖的抑制能力都会受到影响，pH越低或越高，小米多糖的抑制能力越弱，这是由于强酸或强碱会破坏小米多糖的结构，活性降低，从而影响小米多糖的抑菌效果。

图9 不同pH对供试菌的影响

3 结论

用热水提法对沁州小米进行多糖提取，采用单因素试验和响应面优化试验相结合的方法，对小米多糖的提取条件进行优化得出：在提取时间2.1 h、提取温度80℃、料液比19：1条件下，沁州小米多糖的平均提取率为3.066%。通过响应面模型分析可以得出，三个因素对小米多糖提取率的影响顺序为：提取时间＞料液比＞提取温度。对提取出的小米多糖进行抑菌作用研究表明，小米多糖对三种供试细菌都有一定的抑制作用，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度分别为1.1416、2.2832、4.5664 mg/mL。 对在不同温度和pH条件下小米多糖对供试菌的抑菌研究得出，温度的升高并不会明显影响小米多糖的抑菌效果，强酸和强碱会降低小米多糖的抑菌效果，在中性条件下，小米多糖的抑制效果最佳。