卵巢低级别浆液性肿瘤中KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF突变及其与患者临床病理特征和激素表达的相关性分析

陆婷，张娟娟，王晚璞，韦红果，魏金玲，张勇，王丽*

1昆明医科大学第一附属医院肿瘤科，云南昆明 650500；2云南省第一人民医院病理科，云南昆明 650500

卵巢癌是最常见的妇科癌症之一，病死率位居首位[1]。卵巢癌的发生与遗传、环境和生活方式等因素密切相关，怀孕、哺乳和口服避孕药等可降低卵巢癌的发生风险[2-3]。卵巢恶性肿瘤中约90%为上皮性卵巢癌(epithelial ovarian carcinoma，EOC)，其中浆液性卵巢癌(serous ovarian carcinoma，SOC)约占EOC的75%[4]。近年来，已将浆液性卵巢肿瘤分为浆液性囊腺瘤、浆液性交界性肿瘤(serous borderline tumour，SBT)、低级别浆液性癌(lowgrade serous carcinoma，LGSC)和高级别浆液性癌(high-grade serous carcinoma，HGSC)，其中SBT又分为普通型SBT和微乳头型SBT[5-6]。目前认为，LGSC与HGSC在本质上是不同类型的肿瘤，LGSC多见于较年轻的育龄女性，通常继发于SBT，且存在KRAS、NRAS、BRAF基因突变[7-8]。在临床病理中，普通型SBT被认为是微乳头型SBT的前体病变，而微乳头型SBT则被认为是一种非浸润性低级别浆液性癌。KRAS、NRAS、PIK3CA和BRAF基因是表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)依赖的下游信号转导通路RASRAF-MAPK途径和PI3K-AKT途径的4个重要基因，它们可持续激活下游信号通路，引起细胞异常增殖分化，导致肿瘤的发生发展[9-12]。本研究检测KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因在卵巢低级别浆液性肿瘤中的突变情况，并分析其与临床病理特征及雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone receptor，PR)表达的关系，旨在为卵巢浆液性肿瘤的临床诊断、治疗和预后评估提供一定的参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集云南省第一人民医院病理科2017年1月－2021年4月诊断为SBT或LGSC患者的病理资料。排除标准：非原发病例；术前接受新辅助治疗者；无法获得病理石蜡切片标本及临床信息不足者。基于世界卫生组织(WHO)和国际妇产科联盟(FIGO)的相关诊断标准，收集所有标本对应的患者临床资料，包括年龄、累及部位(单侧或双侧)、组织学类型、肿块大小、TNM分期、淋巴结累及情况。共纳入64份甲醛溶液固定石蜡包埋(FFPE)的卵巢浆液性肿瘤组织样本进行评估。所有组织切片均由两位副高级别的医师独立复阅且诊断意见一致。本研究获云南省第一人民医院伦理委员会批准(KHLL2022-YJ005)，所有患者及其家属均签署知情同意书。

1.2 主要试剂及仪器 核酸提取试剂盒、AmoyDx人类KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF基因突变联合检测试剂盒购自厦门艾德生物医药科技股份有限公司；免疫组化试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司；NanoDrop ND-1000购自上海赛默飞创新科技公司。光学显微镜购自德国Leica公司；Applied Biosystems ABI 7500购自上海邦典机电设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 石蜡组织处理 为再次核对石蜡组织切片的肿瘤类型，HE染色后由两位副高级别的病理医师进行评估。随后，按照试剂盒说明书提取石蜡组织DNA。具体操作步骤如下：组织脱蜡后，加入DTL缓冲液和蛋白酶K，混匀后56 ℃消化过夜；加入DES缓冲液，混匀后90 ℃孵育1 h；加入DTB缓冲液和无水乙醇，混匀后13 000×g离心1 min，离心后弃去管中液体；加入DW1缓冲液(已加入17 ml无水乙醇并充分混匀)，10 000×g离心1 min后弃去管中液体；加入缓冲液DW2(已加入24 ml无水乙醇并充分混匀)，10 000×g离心1 min后更换新的收集管，再次13 000×g离心1 min；将DNA吸附柱转移至新的离心管，加入DTE缓冲液，静置5 min后13 000×g离心1 min，离心管中为样品DNA；使用NanoDrop ND-1000测定DNA浓度和纯度，并将DNA稀释至3 ng/μl待用。

1.3.2 基因突变检测 采用扩增阻碍突变系统-聚合酶链反应技术检测人类KRAS基因第2、3、4号外显子上15种体细胞突变(其中12种为热点突变)，NRAS基因第2和3外显子上12种体细胞突变(其中3种为热点突变)，PIK3CA基因20号外显子的2种体细胞突变(其中1种为热点突变)，BRAF基因15号外显子的4种体细胞突变(其中1种为热点突变)。试剂盒采用12联PCR反应条设计，每一个12联PCR条检测一个样本，12联条的1－11号管内装有相应的基因突变检测和内控试剂，12号管作为DNA提取质量的外控检测管。严格按照试剂盒说明书进行样本DNA的浓度稀释、配制、加样、PCR反应循环参数设置及结果分析解释。具体操作如下：分别向体积均为65.8 μl的待测样品DNA、KNPB阳性对照(PC)和纯化水(NTC)中加入4.2 μl KNPB混合酶，混匀后3000×g离心15 s；将混匀的DNA样品依次取5 μl分别加入12联KNPB PCR反应条中，KNPB阳性对照(PC)和阴性对照(NTC)操作同上；按照PCR反应条1－12号管方向，依次将阳性对照、阴性对照和样本KNPB PCR反应条平行放入实时定量PCR仪检测。PCR反应条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 25 s、64 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s，15个循环；93 ℃ 25 s、60 ℃35 s、72 ℃ 20 s，31个循环。

1.3.3 免疫组化检测ER、PR水平 阳性对照为乳腺导管浸润癌组织标本切片，阴性对照则以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗，严格按照制造商说明书进行操作。具体操作如下：将石蜡组织脱蜡至水，PBS洗3次；高压加热EDTA抗原修复液(pH：9.0)修复，PBS洗3次；加3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，室温下孵育15 min后PBS洗3次；加ER抗体或PR抗体，28 ℃下孵育75 min，PBS洗3次；加酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物二抗，28 ℃下孵育45 min，PBS洗4次；DAB显色、苏木精复染、乙醇脱水、二甲苯透明、封片后观察。结果判定标准：ER和PR表达均位于细胞核。以染色强度和阳性细胞综合计分作为判定标准。染色强度(无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分)和阳性细胞百分比(无阳性细胞为0分，阳性细胞≤10%为1分，阳性细胞10%～50%为2分，阳性细胞50%～75%为3分，阳性细胞>75%为4分)分值相乘，乘积不低于3分者判定为免疫组化染色阳性。

1.4 相关指标分析 分析KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因突变的类型和频率，各基因的突变状态与肿瘤组织学类型、患者临床病理特征的关系，以及ER、PR表达与肿瘤组织学类型和各基因突变之间的关系。

1.5 统计学处理 采用SPSS 26.0软件进行统计分析。计量资料以±s表示，肿瘤组织中ER、PR的免疫组化评分比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验；计数资料以例(%)表示，各基因突变状态与不同临床病理特征、激素受体表达状态之间的比较采用χ2检验或Fisher精确概率法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 基本临床资料 64例患者中，普通型SBT 23例，微乳头型SBT 27例，LGSC 14例；≤35岁者30例，>35岁者34例；肿瘤累及单侧42例，双侧22例；肿瘤最大径＜10 cm者38例，≥10 cm者26例；TNM分期为早期(Ⅰ－Ⅱ期)者50例，晚期(Ⅲ－Ⅳ期)者14例；淋巴结受累者3例，淋巴结未受累者61例。

2.2KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因突变的类型和频率 共检测出36例突变，其中KRAS突变21例、BRAF突变12例、PIK3CA突变2例、NRAS突变1例。KRAS突变均为2号外显子的12、13密码子突变，检出率为32.8%(21/64)，其中G12S、G12D占42.9%(9/21)，G12C、G12R*、G12V、G12A、G13C*占47.6%(10/21)，G13D占9.5%(2/21)。BRAF突变检出率为18.8%(12/64)，突变类型为V600E、V600K*、V600R*、V600D*。PIK3CA突变检出率为3.1%(2/64)，突变类型为H1047R、H1047L*。NRAS突变检出率为1.7%(1/64)，突变类型为G13R*、G12C*、G12V*、G12A*、G13V*。未发现KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因之间存在交叉突变。基因突变扩增图谱详见图1。

图1 卵巢浆液性肿瘤基因突变的扩增图谱Fig.1 Amplification map of the gene mutations in ovarian serous tumors

2.3 各基因突变状态与肿瘤组织学类型的关系普通型SBT组织中基因突变检出率(73.9%)最高，其次为微乳头型SBT(51.9%)，LGSC最低(35.7%)。SBT与LGSC间BRAF突变检出率差异无统计学意义(P>0.05)。在KRAS突变亚型中，普通型SBT组织中G12C、G12R*、G12V、G12A、G13C*的检出率明显高于微乳头型SBT和LGSC(P＜0.05)，而微乳头型SBT组织中KRAS突变亚型G12S、G12D的检出率高于普通型SBT和LGSC(P＜0.05)。KRAS突变亚型G13D仅在LGSC中被检出，明显高于普通型SBT和微乳头型SBT(P＜0.05)，卵巢浆液性肿瘤中KRAS、BRAF突变类型详见表1。此外，1例NRAS突变在LGSC中被检出，2例PIK3CA突变分别在LGSC、微乳头型SBT中被检出。

表1 卵巢浆液性肿瘤中KRAS、BRAF突变分析[例(%)]Tab.1 Analysis of KRAS and BRAF mutations in ovarian serous tumors [n(%)]

2.4 各基因突变状态与临床病理特征的关系≤35岁患者的肿瘤组织中KRAS总突变率明显高于>35岁者(P=0.027)，其中以G12C、G12R*、G12V、G12A、G13C*突变最突出，但差异无统计学意义(P=0.052)。KRAS突变亚型在不同肿瘤累及部位、TNM分期、肿瘤最大径及淋巴结累及患者中差异无统计学意义(P>0.05)。BRAF突变常发生于≤35岁(P=0.030)或单侧受累(P=0.015)的患者。所有BRAF突变均见于疾病早期阶段的患者，且无淋巴结受累。BRAF突变在不同TNM分期、肿瘤最大径及淋巴结累及患者中差异无统计学意义(P>0.05，表2)。NRAS、PIK3CA突变在不同临床病理特征的患者中差异均无统计学意义(P>0.05)。

表2 卵巢浆液性肿瘤KRAS、BRAF突变与临床病理特征的关系Tab.2 Relationship between KRAS and BRAF mutations and the clinicopathological features in ovarian serous tumors

2.5 ER、PR表达与肿瘤组织学类型的关系 64例标本中ER、PR的免疫组化平均得分分别为6.7分、7.2分，其中普通型SBT、微乳头型SBT、LGSC中ER平均得分分别为6.7分、8.6分、3.0分，PR平均得分分别为8.4分、8.8分、2.4分。ER和PR阳性表达率均为76.6%(49/64、49/64)。免疫组化检测结果显示，普通型SBT、微乳头型SBT中的ER、PR表达水平均明显高于LGSC(P＜0.01或P＜0.001)，而普通型SBT与微乳头型SBT间差异无统计学意义(P>0.05)(图2)。

图2 卵巢浆液性肿瘤中ER、PR的表达情况Fig.2 Expression of ER and PR in ovarian serous tumors

2.6 各基因突变类型与ER、PR表达的关系 在36例基因突变组织中，ER、PR阳性表达率(均为86.1%)明显高于阴性表达率(分别为13.9%、13.9%)。21例KRAS突变组织中，ER、PR阳性表达率分别为90.5%、85.7%，其中G12S、G12D突变中ER、PR阳性表达率均为38.1%，G12C、G12R*、G12V、G12A、G13C*突变中ER、PR阳性表达率均为47.6%，G13D突变中ER、PR阳性表达率分别为4.7%、0.0%。KRASG13D突变组织中PR阴性表达率明显高于阳性表达率(P=0.014)(表3)。12例BRAF突变组织中，ER、PR阳性表达率分别为83.3%、91.7%；2例PIK3CA突变组织中，ER、PR阳性表达率均为50.0%；1例NRAS突变组织中，ER、PR阳性表达率均为100%。BRAF、NRAS、PIK3CA突变组织中的ER、PR阳性表达率差异均无统计学意义(P>0.05)。

表3 卵巢浆液性肿瘤KRAS突变亚型与ER、PR表达率的关系Tab.3 Association between KRAS mutant subtypes and ER and PR expression in ovarian serous tumors

3 讨 论

EOC是一组异质性肿瘤，包括具有不同临床病理和分子特征的各种恶性肿瘤，而浆液性卵巢肿瘤是其最常见的组织类型，因而需要更好地了解其分子基础。影响细胞内信号转导通路的致癌突变与癌变直接相关。RAS/RAF/MAPK和PI3K/AKT/mTOR通路是细胞内信号转导中最重要的机制，因此，检测卵巢浆液性肿瘤中KRAS、NRAS、PIK3CA和BRAF的突变状况，有助于探索这些基因突变与癌变及临床病理特征之间的关系。

在不同类型的癌症中，KRAS、NRAS、PIK3CA和BRAF基因的突变频率不同[13-15]。本研究发现普通型SBT的基因突变检出率为73.9%(17/23)，其中39.1%(9/23)为KRAS突变、34.8%(8/23)为BRAF突变；微乳头型SBT的基因突变检出率为51.9%(14/27)，其中37.0%(10/27)为KRAS突变、3.7%(1/27)为PIK3CA突变、11.1%(3/27)为BRAF突变；LGSC的基因突变检出率为35.7%(5/14)，其中14.3%(2/14)为KRAS突变、7.1%(1/14)为NRAS突变、7.1%(1/14)为PIK3CA突变、7.1%(1/14)为BRAF突变。由此可见，随着疾病的进展，卵巢低级别浆液性肿瘤组织中BRAF、KRAF基因突变率逐渐下降，其中BRAF突变最明显。BRAF、KRAS基因突变与卵巢浆液性肿瘤的组织学类型相关，SBT组织中基因突变率高于LGSC，且相对于BRAF基因突变，LGSC组织中KRAS基因突变更为常见。KRAS、NRAS和PIK3CA突变可能是LGSC的致癌驱动因子。

KRAS突变与SBT的浸润性植入明显相关，是肿瘤复发风险增高和患者生存率降低的重要预后指标[16]。Tsang等[17]发现，在未复发的SBT中BRAFV600E突变常见，而在复发的LGSC中KRAS基因突变更常见(>70%)，且带有KRASG12V突变的患者总生存期较无该突变者缩短，这与Renaud等[18]的研究结果相似，后者发现存在KRASG12V突变的非小细胞肺癌患者表现出较差的总生存期和较高的复发率。Ohnishi等[19]基于Sanger测序发现，携带KRASG12D或G13D突变的黏液性交界性卵巢肿瘤可能更易进展为黏液性卵巢癌。另一项研究发现，与KRASG12V突变相比，具有KRASG12D突变的LGSC患者预后相对良好，但差异无统计学意义[20]。本研究发现，在普通型SBT和微乳头型SBT组织中，KRAS基因总突变率相似(39.1%vs. 37.0%)，但突变亚型存在明显差异：G12C、G12R*、G12V、G12A、G13C*突变更常见于普通型SBT(P＜0.05)，在LGSC中未被检出；G12S、G12D突变多见于微乳头型SBT(P＜0.05)，在LGSC中未被检出；KRASG13D突变仅在2例LGSC中被检出。KRAS突变亚型可能与患者的预后有关，但由于本研究纳入病例不多，且缺乏跟踪随访记录，未能明确各突变亚型与患者预后的联系，有待后续扩大样本量进一步研究。

Malpica等[21]发现，含有SBT成分的卵巢浆液性囊腺瘤中可检测到BRAF或KRAS突变，而在单纯的浆液性囊腺瘤中未检测出该突变。具有BRAFV600E突变的SBT进一步发展为浆液性癌的风险相对较低，且发生该突变的LGSC患者多处于疾病早期阶段，晚期罕见[22-24]。Zeppernick等[25]发现，携带BRAF突变的SBT与细胞衰老相关的标志物p16和肿瘤抑制基因上调有关，患者预后较好。本研究结果显示，BRAF基因突变仅见于疾病早期阶段，12例SBT患者均为Ⅰ期，1例LGSC患者为Ⅱ期。此外，与微乳头型SBT比较，普通型SBT组织中BRAF基因突变率明显增高，而LGSC中则少见BRAF基因突变，这与Turashvili等[26]和Chui等[27]的报道一致，提示BRAF突变可能抑制了SBT向LGSC的进展。

本研究仅在1例Ⅲ期LGSC组织中检测出NRAS外显子2突变(7.1%)，提示NRAS突变率较低，且可能与疾病进展和患者不良预后有关。这与Xing等[28]的发现一致，后者在SBT中均未检测出该突变(0/42)，仅在3.6%的LGSC中检测出NRASQ61R突变(2/56)。Al-Qahtani等[29]发现，PIK3CA基因突变在EOC中的发生率较低(3.0%～12.8%)，可通过介导PI3K/AKT信号通路改变而引起恶变。此外，Al-Qahtani等[29]还发现，PIK3CA突变与患者年龄及不良预后呈正相关，且多见于SOC和子宫内膜癌。本研究在Ⅱ期LGSC和Ⅱc期微乳头型SBT中各检测出1例PIK3CA基因突变(7.1%、3.7%)，提示PIK3CA突变在浆液性卵巢癌的发生发展中可能起到一定作用，但仍有待后续扩大样本量进一步明确。

据报道，LGSC的发病机制可能与女性激素有关[7]，与ER或PR阴性表达者相比，ER或PR阳性的SOC患者预后相对较好[30-31]。Ring等[32]通过查询癌症基因组图谱和体外实验发现，携带KRAS突变的肿瘤PR表达明显降低(P=0.047)，携带KRAS突变的子宫内膜癌细胞中ERα和PR的表达明显降低(P≤0.001)。结合本研究KRAS突变类型与肿瘤组织学类型和激素表达状态之间的关系，提示随着疾病的发展，KRAS突变类型可能发生改变，且携带G13D突变亚型的肿瘤中ER或PR阳性表达率明显低于其他突变亚型，推测G13D突变可能通过某一途径介导ER或PR低表达，但不排除受肿瘤组织学类型的影响所致。Vannucchi等[33]发现，在ERα或PR高表达的甲状腺乳头状癌中，BRAFV600E突变的发生率较高。Liu等[34]发现，在ER或PR阳性表达的乳腺癌患者中，较高的BRAF/MEK通路活性与生存率更高有关。本研究结果显示，BRAF突变组织中ER和PR阳性表达率分别为83.3%、91.7%，结合临床病理资料，提示BRAF突变与ER、PR表达有关，携带该突变的患者预后较好。尽管在黑色素瘤中ERβ激动剂可抑制携带NRAS突变的癌细胞的增殖[35]，在不同ERα和PR表达状态的乳腺癌中PIK3CA突变频率存在明显差异[36-37]，但本研究未发现NRAS或PIK3CA突变与ER或PR的表达状态有关，这可能与样本量不足有关。

本研究在KRAS、NRAS、PIK3CA和BRAF突变检测中未发现交叉突变。KRAS、BRAF突变与患者的年龄、组织学类型有关。ER、PR高表达在SBT向LGSC发展过程中起抑制作用。KRAS突变可能是浆液性肿瘤的致癌驱动因子，在不同组织学类型中突变亚型存在明显差异。KRASG13D突变与LGSC的关系较为突出，与PR阴性表达也明显相关，是LGSC的重要致癌基因，可能成为预测患者预后的重要指标，但仍有待进一步研究。BRAF突变具有两面性，一方面在疾病早期阶段促进肿瘤的发生，另一方面又可阻碍SBT向LGSC的进一步发展。NRAS突变仅发生于少数的LGSC。NRAS、PIK3CA突变在浆液性卵巢癌的发生发展中起重要作用，但由于样本量有限，未发现有统计学意义的结果，有待扩大样本量进一步明确。卵巢浆液性肿瘤患者进行KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF突变检测可以为临床诊治、预后评估提供指导。