脂多糖刺激干扰素调节因子3促进小鼠腹腔巨噬细胞白介素-17表达

李 婷 黄小园 马 凤 廖承浩 王 凯

（1 杭州医学院基础医学与法医学院，杭州 311399；2 浙江大学医学院附属口腔医院，浙江大学口腔医学院，浙江省口腔生物医学研究重点实验室， 杭州 310006；3 浙江大学医学院附属第二医院，杭州 310009）

脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）是革兰阴性菌内毒素，为引起炎症的病原模式相关分子（pathogen associated molecular pattern， PAMP），可与Toll 样受体4（Toll like receptor 4， TLR4）特异性结合，激活炎症反应信号转导通路[1]。白细胞介素-17（interleukin-17，IL-17）主要由CD4+T细胞亚群分化形成Th17细胞后所分泌的炎症因子[2]，在自身免疫病和慢性炎症中作为驱动因素受到关注[3]。

LPS刺激可促进IL-17的产生[4-5]。在妊娠期间接触病毒所引发的IL-17相关的母体免疫应答，会增加后代神经系统发育异常的风险，如自闭症[6]。干扰素调节因子（interferon regulatory factor 3，IRF3）是转录因子，可促进干扰素β（interferon-β，IFN-β）的产生，从而抵抗病毒感染[7]。在不同的刺激条件下，IRF3还可以促进IL-6、CXCL9、CXCL10和CCL5等炎症因子的产生[7-10]。本研究针对IL-7产生相关的细胞因子及转录因子进行了初步检测，探讨LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞后IRF3对IL-17表达的影响。

1 材料和方法

1.1 动物和试剂

C57BL/6野生型小鼠和IRF3基因敲除小鼠饲养于杭州师范大学实验动物中心，取6～8周龄雄性小鼠进行实验。3% 巯基乙酸肉汤（70157）和脂多糖（L2880）购自Sigma；胎牛血清（11012-8611）购自四季青生物；DMEM高糖培养基（MA0212）和BCA蛋白浓度测定试剂盒（MA0082）购自美仑生物；BSA封闭液（E661003）购自生工生物；β-actin（#3700）、NFκB（#8242）、核因子IκB抑制蛋白α（IκBα）（#9242）、磷酸化信号转导子和转录激活子3（phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3，p-STAT3）（#9131）、Anti-Rabbit-HRP（#7074）及Anti-Mouse-HRP（#7076）抗体购自Cell Signaling Technology；IL-6 DuoSet ELISA（DY406）和IL-17 DuoSet ELISA（DY421）购 自R&D System； Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate（ECL）（WBKLS0100）购于MILLIPORE公司。

1.2 小鼠腹腔巨噬细胞的提取与培养

C57BL/6品系野生型和IRF3基因敲除小鼠，腹腔注射3%巯基乙酸肉汤2.5 mL，3 d后将小鼠颈椎脱臼处死，用75%乙醇浸泡3 min。腹腔内注入5 mL预冷的1×PBS灌洗腹腔，重复3次。收集的灌洗液在1 500 r/min离心5 min，弃去上清液，PBS洗涤2次，得到野生型和IRF3基因敲除组小鼠腹腔巨噬细胞，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基重悬细胞，2组细胞分别分成4组，接种于6孔板中。待细胞贴壁后，吸去上清液，去除未贴壁细胞，PBS洗涤3次后加入2 mL培养液，继续过夜培养备用。

1.3 酶联免疫吸附试验检测IL-17、IL-6的表达

用100 ng/mL的LPS预处理小鼠腹腔巨噬细胞6、12、24 h后收取上清液，检测细胞因子IL-17、IL-6。按照ELISA试剂盒说明书的操作步骤进行：将100 μL捕获抗体置于96孔板中室温孵育过夜，次日每孔加入300 μL洗涤液进行洗涤，重复3次（简称洗涤，下同）。加入300 μL封闭液封闭1 h，洗涤。加入100 μL标准品或者样品孵育2 h，洗涤。加入100 μL检测抗体孵育2 h，洗涤。加入100 μL辣根过氧化物酶标记链霉亲和素避光孵育20 min后，洗涤。加入100 μL的底物避光孵育20 min后，加入50 μL终止液，用酶标仪读取吸光度进行分析。

1.4 免疫印迹检测IκBα、IRF3、p-STAT3的蛋白水平

LPS预处理各组细胞，用预冷的1× PBS清洗，彻底吸除液体后，每孔加入100 μL的RIPA细胞裂解液（含有磷酸酶抑制剂和PMSF），冰上裂解30 min。收集裂解液在12 000 r/min离心30 min后收集上清液。用BCA蛋白浓度测定盒（MA0082，美仑生物）测得蛋白浓度后定量，加入等量的5×样品缓冲液，100℃加热5 min。待蛋白冰上冷却后，每孔加40 μg蛋白样品，10% SDS-PAGE胶、80 V电泳。在电压100 V进行75℃转膜，将蛋白转到PVDF膜上。BSA封闭液室温孵育膜1 h，目标条带分别加入一抗IκBα、IRF3、p-STAT3、β-actin，4℃摇床过夜。次日1×（TBS＋吐温20）洗5 min，共3次。加入二抗，室温摇床孵育2 h后，洗3次，加入ECL显色液于暗室中曝光。

2 结果

2.1 IRF3促进LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞IL-17和IL-6的产生

IRF3显著地促进小鼠巨噬细胞IL-17的产生（24 h），而IRF3基因缺失的巨噬细胞几乎未产生IL-17（图1A）。LPS刺激巨噬细胞6 h后即可观察到IRF3明显促进IL-6的产生，IRF3基因缺失的巨噬细胞未产生IL-6（图1B）。提示用LPS刺激小鼠巨噬细胞后，IRF3可促进IL-17和IL-6的产生，且IL-6的产生早于IL-17。

图1 IRF3在LPS刺激后促进小鼠巨噬细胞IL-17（A）及IL-6（B）的表达，酶联免疫吸附检测

2.2 IRF3促进小鼠腹腔巨噬细胞STAT3的磷酸化

免疫印迹结果显示，在IRF3基因缺失小鼠巨噬细胞中未观察到IκBα的降解，但在野生小鼠巨噬细胞中IκBα明显被降解（图2）。在LPS刺激时IRF3促进STAT3的磷酸化，且在IRF3基因缺失小鼠巨噬细胞中的表达量与野生型相比明显降低（图2）。

图2 IRF3在LPS（100 ng/mL）刺激小鼠腹腔巨噬细胞后促进STAT3的磷酸化，免疫印迹

3 讨论

LPS是革兰阴性菌的内毒素，可激活MyD88依赖性的NF-κB和MyD88非依赖性的IRF3转录因子，引起众多细胞因子产生[11]。LPS刺激还可以引起IL-17的产生。在LPS诱导的鼻炎模型中，IL-17的产生呈现出LPS刺激剂量依赖性特征[4]。IRF3对IL-17表达的影响存在争议。有研究表明IRF3参与调节IL-17产生[7-8，11]；在肝缺血再灌注模型中IRF3抑制IL-17产生[8]；用poly（I：C）刺激CD8 T淋巴细胞时IRF3与RORγt相互作用，抑制IL-17表达[7]。但另一方面，IRF3可以促进IL-17产生，从而影响抗原提呈细胞的功能[11]。本研究结果表明IRF3促进IL-17的产生。

IL-6是NF-κB的重要产物，IRF3可促进IL-6的产生[11-14]。IL-6是小鼠促进IL-17产生的重要细胞因子[15]。小鼠的Th17细胞分化依赖于TGF-β和IL-6，这些细胞因子促进信号转导及STAT3的活化，从而促进IL-17产生[16]。本研究结果显示，IRF3促进IL-6产生，但在IRF3基因敲除小鼠巨噬细胞中几乎没有IL-6。IκBα是NFκB的抑制蛋白，磷酸化而被降解后激活NFκB的转录活性，促进靶基因产生[17-18]。在LPS刺激时IRF3促进IκBα降解，但未检测到NF-κB（Ser536）磷酸化，而在IRF3基因敲除巨噬细胞中几乎没有IκBα蛋白降解。

IL-6可以通过激活STAT3而促进小鼠IL-17的产生[15，19]，STAT3是IL-17的转录因子[15，20]。本研究结果显示，IRF3促进STAT3的磷酸化，在IRF3缺失时明显被抑制。由此推测，IRF3在LPS刺激时促进IL-17的产生，可能是通过促进IL-6的产生，从而激活IL-17的转录因子STAT3。IRF3促进IL-17产生的这一过程中可能伴随IL-6的产生和STAT3的磷酸化。这一研究将为深入研究巨噬细胞IRF3在LPS刺激时促进IL-17的分子机制提供基础数据。