miR-30c通过调节海马神经发生对APP/PS1转基因小鼠学习记忆能力的影响*

孙婷婷 董树燕 李鲁萍 赵传华 李天鹏

（枣庄学院，1 食品科学与制药工程学院；2 枣庄市神经退行性疾病与神经药物研发重点实验室；3 城市与建筑工程学院，枣庄 277160）

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一渐进性神经退行性疾病，其典型特征表现为记忆力和认知能力的减退以及中枢神经系统出现一系列病理改变，其形成机制不明，并且无特效治疗药物[1-3]。研究表明，AD患者脑较之正常人脑有明显的萎缩[4-5]，并且AD患者海马神经发生的改变在其典型病理和大量神经元丢失之前就已经出现[6-7]，推测海马神经发生在AD的病理形成和进展中具有重要的作用。通过丰富环境（给实验动物提供丰富的学习环境）、机械或药物损伤海马等方法使海马神经发生产生变化，可用于进行新生神经细胞的功能研究。然而，这些研究往往得出相悖的结论，可能与这些研究所用的手术模型不同有关[8-11]。至今，对于AD神经发生的变化与学习记忆的关系一直存在争论[12-15]。microRNA是重要的转录后调控因子，参与发育过程的时序调节、细胞周期及分化等过程。本课题组前期的研究发现，miR-30c过表达可明显增强C57BL/6J小鼠室下区的神经发生[16]。本研究以APP/PS1转基因小鼠为研究对象，通过microRNA过表达和敲减慢病毒载体干扰海马齿状回处miR-30c的表达来检测神经发生与学习记忆的关系。

1 材料和方法

1.1 材料、试剂与仪器

18～24 g的8周龄SPF级APP/PS1转基因小鼠由南京模式动物中心提供；兔单克隆抗体Ki67购自美国Thermo Fisher公司；鼠单克隆抗体GFAP购自美国Cell Signaling Technology公司；Alexa Fluor®488标记的驴抗兔抗体和Alexa Fluor®594标记的驴抗鼠抗体购自美国Jackson ImmunoResearch Laboratories公司；TRIzol试剂购于美国Invitrogen公司；反转录试剂盒PrimerScript®RT reagent Kit、实时荧光定量PCR试剂盒SYBR Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）购自日本TaKaRa公司；实验中所用引物由上海生工生物工程公司合成；Morris水迷宫及图像自动监视处理系统购自上海软隆科技有限公司；冷冻高速离心机、PCR扩增仪购自德国Eppendorf公司；实时荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司；超纯水仪购自美国Millipore公司；正置荧光显微镜购自日本Olympus公司；激光共聚焦购自日本Nikon公司；脑立体定位仪购自瑞沃德生命科技有限公司；凝胶成像仪购自北京君意东方电泳科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 实验动物分组

初始实验小鼠分为APP/PS1转基因小鼠和同窝野生小鼠2组，分别从2组中随机选取12只以检测2组小鼠在海马神经发生和学习记忆上的差异。后续从APP/PS1转基因小鼠中随机选取36只分为3组：APP/PS1假手术组（AD组，脑立体注射1 μL生理盐水）、miR-30c过表达组（OE组， 脑立体注射1 μL miR-30c过表达慢病毒）和miR-30c敲减组（KD组，脑立体注射1 μL miR-30c敲减慢病毒），以检测APP/PS1转基因小鼠中miR-30c的表达变化对海马神经发生和学习记忆的影响。

1.3 APP/PS1阳性转基因小鼠鉴定

对APP/PS1小鼠繁殖的后代进行基因型鉴定，剪取小鼠足趾约2 mm，加入50 mmol/L NaOH 100 μL 100℃下裂解1 h，之后加入Tris-HCl(pH=8.0) 10 μL，12000 r/min离 心20 min，取 上清进行PCR。反应体系为15 μL，其中DNA模板3 μL，2×Taq master mix 7.5 μL，上下游引物各0.5 μL，特异性引物序列：PP-15975'-GACTGACC ACTCGACCAGGTTCTG-3'；PP-15985'-CTTGTAA GTTGGATTCTCATATCCG-3'；PP-1644 5'-AATA GAGAACGGCAG GAGCA-3'；PP-1645 5'-AA TAGAGAACGGCAGGAGCA-3'，ddH2O 3.5 μL。PCR反应条件：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，63℃退火35 s和72℃ 延伸45 s，进行30个循环，然后72℃延伸3 min。产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶成像系统记录鉴定结果。

1.4 Real-time PCR

利用TRIzol对APP/PS1假手术组、miR-30c过表达组和miR-30c敲减组3组样本的海马组织进行裂解。RNA浓度和纯度达到标准后（浓度大于200 ng/μL，A260/A280介 于1.9～2.0），利 用cDNA试剂盒和合成的特异性的颈环引物进行反转录（表1），反应体系总体积5 μL，总RNA 模板250 ng，反应体系配制参照试剂盒说明，于42℃反应1 h，并于70℃加热15 min以使反转录酶失活。随后利用SYBR®Premix Ex TaqTM实时定量PCR试剂盒进行扩增，反应条件SYBR Premix Ex Taq 10 μL，Primer mix （10 μmol/L）4 μL（引物序列见表1），cDNA 50 ng，ddH2O补足至20 μL。扩增反应程序为：95℃预变性2 min，95℃ 5 s，57℃ 30 s，40个循环，解离程序为：65℃ 5 s，95℃ 5 s。Snord2作为内参，每个样品重复3次，实验结果采用2-△△CT方法进行分析。

1.5 脑立体定位

每组取12只5月龄APP/PS1转基因小鼠，行腹腔注射进行麻醉（5%戊巴比妥钠，70 mg/kg），脑立体定位仪上固定小鼠，暴露脑颅骨，剔除脑膜。以前囟作为坐标零点进行校正。病毒注射坐标为：bregma -1.75 mm，lateral -0.75 mm，ventral+2.3 mm，注射速度为0.2 μL/min，注射完毕后针头留置20 min再缓慢退出进样针。切口缝合后，给予保温措施直至小鼠能够自主活动，其中miR-30c过表达组注射含miR-30c-OE病毒，miR-30c敲减组注射miR-30c-KD病毒，病毒滴度均在5×108TU/mL～1×109TU/mL（病毒注射量为1 μL），APP/PS1假手术组注射1 μL生理盐水。手术结束4周后进行免疫荧光和学习记忆行为学检测。

1.6 水迷宫检测

对6月龄APP/PS1转基因小鼠和同窝野生小鼠以及APP/PS1假手术组、miR-30c过表达组和miR-30c敲减组小鼠的空间学习记忆能力进行检测。首先让小鼠熟悉学习记忆环境，进行适应性游泳。之后进行为期5 d的学习记忆训练，每天训练4个象限，记录小鼠寻找固定平台所需时间。记录小鼠90 s内寻找到平台对应的时间，超过90 s记为90 s。第6 天将平台去除，记录小鼠穿过平台的次数。

1.7 脑片制备

利用5%戊巴比妥钠溶液行腹腔注射对小鼠进行深度麻醉（75 mg/kg），剪开胸腔，通过左心室穿刺，剪开右心耳，依次用0.01 mol/L PBS和4%多聚甲醛经心灌注和在体固定。分离脑，4%多聚甲醛于4℃固定过夜，之后进行梯度蔗糖脱水、OCT包埋和进行厚度为20 μm的连续矢状冰冻切片。

1.8 免疫荧光染色

本实验所用一抗为兔单克隆抗体Ki67（1∶400），鼠单克隆抗体GFAP（1∶500）。切片预处理后用含有0.2% Triton X-100和5%驴血清的封闭液室温封闭45 min，加入一抗4℃孵育过夜。实验所用二抗分别是AlexaFluor®488驴抗兔（1∶500）和AlexaFluor®594驴抗鼠（1∶500），二抗室温孵育2 h。PBS清洗后，滴加抗淬灭荧光封片剂进行封片。

1.9 统计学处理

免疫荧光染色中Ki67阳性细胞用软件Image-Pro Plus 6.0进行采集，以各组除以对照组Ki67阳性细胞的平均值，得出Ki67阳性细胞的相对倍数。数据用±s表示，使用SPSS 2020进行统计学分析，APP/PS1转基因小鼠与同窝野生小鼠之间的统计学分析采用独立样本t检验，APP/PS1假手术组、miR-30c过表达组及miR-30c敲减组小鼠之间的统计学分析采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 APP/PS1转基因小鼠的神经发生与同窝野生小鼠相比明显下降

APP和PS1的特异性引物对APP/PS1转基因小鼠鉴定结果显示，阳性小鼠在350 bp和608 bp处呈现特异性扩增条带（图1A）。随后，利用Ki67抗体对6月龄和同窝野生小鼠的增殖细胞进行检测，其中Ki67蛋白参与染色体的组装过程，在有丝分裂中具有维持染色体的分散状态的功能，所以Ki67可作为一种增殖的标志物用于神经细胞增殖的检测。免疫荧光检测结果显示，6月龄APP/PS1转基因小鼠的Ki67阳性增殖性神经细胞数量明显少于同窝野生小鼠，约是同窝野生小鼠的0.25倍（P＜0.001）（图1B～C）。

图1 APP/PS1转基因小鼠海马神经发生检测。A：2对引物（引物1597/1598，目标扩增条带为305 bp；引物1644/1645，目标扩增条带为608 bp）对APP/PS1转基因小鼠进行鉴定，其中虚线框为第1窝小鼠样本；实线框为第2窝小鼠样本；剩下样本为第3窝小鼠样本；M：DNA ladder。B：6月龄APP/PS1转基因小鼠和同窝小鼠海马新生神经元免疫荧光检测，标尺=100 μm，WT：野生小鼠；AD， APP/PS1转基因小鼠；C：6月龄APP/PS1转基因小鼠和同窝野生小鼠海马Ki67阳性细胞相对倍数的统计结果，**P＜0.001 vs WT.

2.2 APP/PS1转基因小鼠与同窝野生小鼠相比学习记忆能力明显下降

水迷宫实验结果显示，与同窝野生小鼠相比，APP/PS1转基因组小鼠要用更多的时间才能找到平台[APP/PS1转基因组：（60.6±6.54） s；WT组：（43.1±4.15） s，P＜0.05]，并且第6天 的APP/PS1转基因组小鼠穿过驻台次数也明显比同窝野生小鼠少。结果说明APP/PS1转基因小鼠的学习记忆能力比同窝野生小鼠明显降低（P＜0.001）（图2）。

图2 APP/PS1转基因小鼠与同窝小鼠学习记忆的差异。A：第6天水迷宫检测APP/PS1转基因小鼠和同窝小鼠找到驻台的时间；B：第6天水迷宫检测APP/PS1转基因小鼠和同窝小鼠穿过驻台区域的次数（WT：野生小鼠；AD，APP/PS1转基因小鼠）。*P＜0.05，**P＜0.01 vs WT.

2.3 miR-30c过表达和敲减载体干预海马的神经发生

为了验证海马齿状回处神经发生与学习记忆能力之间的关系，利用之前构建并包装好的miR-30c过表达和miR-30c敲减慢病毒来干预海马齿状回处的神经发生。本课题组之前的研究已经证实miR-30c能够调控侧脑室室下区的神经发生能力，并且miR-30c过表达后侧脑室室下区的新生神经细胞增加，而miR-30c敲减后，侧脑室室下区的新生神经元减少[16]。为了检测miR-30c过表达和敲减载体对APP/PS1转基因小鼠海马齿状回处新生神经细胞数量的影响（相应引物见表1），利用脑立体定位技术，将上述2种慢病毒载体分别注射于6月龄APP/PS1转基因小鼠中。手术恢复4周后，利用qRT-PCR对海马齿状回处miR-30c的表达（相应引物见表1）和免疫荧光对海马神经发生情况进行检测，结果显示，miR-30c过表达载体和敲减载体能够顺利表达，其中miR-30c过表达组miR-30c的表达量是对照组的（8.34±0.24）倍，miR-30c敲减组miR-30c的表达量是对照组的（0.45±0.02）倍（图3 A～B），并且miR-30c过表达后海马齿状回处的神经发生明显增加，约是对照组的14.20倍（P＜0.01）。miR-30c敲减后海马新生神经细胞数量较对照组有所降低（P＜0.05，图3 C～D）。Encinas等[17]提出随着年龄的增加海马神经发生能力几乎枯竭，故在此基础上 进一步降低神经发生，其变化不明显。

表1 miR-30c过表达、敲减序列及qRT-PCR检测所用引物

图3 APP/PS1转基因小鼠中miR-30c过表达、敲减后引起的神经发生变化。A：脑立体定位显微注射miR-30c过表达和miR-30c敲减慢病毒模式示意图，注射位置为海马齿状回，注射坐标为bregma -1.75 mm，lateral -0.75 mm，ventral +2.3 mm；B：脑立体定位4周后，qRT-PCR检测海马miR-30c的相对表达量（*P＜0.05，**P＜0.001 vs AD组）； C：APP/PS1转基因小鼠中miR-30c过表达和敲减后新生神经细胞的免疫荧光检测，标尺=100 μm；D：APP/PS1转基因小鼠中miR-30c过表达和敲减后新生神经细胞的统计结果（*P＜0.05，**P＜0.001 vs AD组）.

2.4 miR-30c引起的新生神经细胞的增减与学习记忆能力的关系

综上表明，miR-30c可以有效的调控海马齿状回处新生神经元的数量。那么，小鼠的学习记忆能力是否会受到影响呢？本研究利用水迷宫对上述APP/PS1转基因小鼠、miR-30c过表达的APP/PS1转基因小鼠和miR-30c敲减的APP/PS1转基因小鼠的学习记忆能力进行检测。对3组小鼠进行了为期5 d的训练和最后一天穿过驻台次数进行检测。第6 天的测试结果显示，与其他2组相比，miR-30c敲减组小鼠需要更多的时间才能找到平台[AD组（60.1±6.91） s；KD组（82.3±3.25） s；OE组（38.02±3.46） s]，并且miR-30c敲减组小鼠的穿驻台次数明显低于其他2组（P＜0.05vsAD组，P＜0.001vsOE组）（图5），miR-30c过表达组小鼠寻找驻台的时间降低，并且穿过驻台的次数比AD组有所增加（P＜0.05）（图4）。

图4 水迷宫检测APP/PS1转基因小鼠中miR-30c过表达和敲减后学习记忆的变化

3 讨论

以往β淀粉样蛋白半乳糖等方法建立的动物模型只能表现出AD的部分病理改变，不完全具备AD的病理特征[18-19]，这极大限制了对AD发病机制的研究。而本实验所用的APP/PS1转基因小鼠是过表达APP（APP淀粉样蛋白前体基因）和PS1（早老素基因），是较为经典的AD动物模型。此种小鼠在6月龄时就有明显的AD病理现象即Aβ淀粉样蛋白沉积，9月龄时就有明显的神经元缺失。结果显示6月龄APP/PS1转基因小鼠神经发生明显下降，表现为增殖性神经细胞数量的明显减少，同时本研究利用水迷宫实验检测了APP/PS1转基因小鼠的空间学习记忆能力，发现其学习记忆能力也明显比同窝野生组小鼠差，说明新生细胞参与了海马的空间记忆过程。之前有研究利用慢病毒追踪技术，显示海马齿状回处新生神经元与内嗅皮层成熟的颗粒细胞间形成突触连接，并且有研究表明，正常小鼠每天两侧海马中约有1 400个新生神经元产生，占总海马新生神经元的1.8%，所以海马颗粒细胞层的神经元不断地处于更替状态中[20]，并有可能参与正常的学习记忆过程[21-22]。

为了进一步验证成年神经发生与学习记忆能力之间的关系，本研究利用miR-30c过表达和敲减慢病毒载体，对APP/PS1转基因小鼠海马齿状回处的神经发生进行干预，显示当利用miR-30c敲减慢病毒载体，可引起APP/PS1转基因小鼠海马齿状回处的神经发生减少，表现为增殖性细胞的减少，其对应的空间学习记忆能力则明显降低；而miR-30c过表达慢病毒载体可以使APP/PS1转基因小鼠海马齿状回处的神经发生明显增加，对应的空间学习记忆能力有所增强。

综上所述，本研究结果显示6月龄APP/PS1转基因小鼠的神经发生比正常组低，且这些新生细胞的减少，会导致学习记忆能力的明显降低，说明AD小鼠海马学习记忆功能的维持需要一定量的新生细胞数量，提示miR-30c的表达与APP/PS1转基因小鼠海马脑区神经发生直接相关，miR-30c表达敲减，神经发生降低，并且对应的学习记忆能力明显降低；miR-30c过表达，神经发生增加。然而，学习记忆能力的增减与神经发生的变化并非是直线性的，后期需要对新生细胞增殖的分化和成熟过程做详细的追踪，并对APP/PS1转基因小鼠海马神经发生与学习记忆变化间的阈值进行鉴定。