神经元钙信号系统异常与阿尔茨海默病的“钙假说”

王刘清， 窦 非， 王友军*

(1)北京师范大学生命科学学院遗传与发育所，抗性基因资源与分子发育北京市重点实验室， 北京 100875；2)认知神经科学与学习国家重点实验室，基因工程药物及生物技术北京市重点实验室， 北京 100875)

钙离子(calcium ion, Ca2+)是自然界中一种普遍存在的二价阳离子。生物体内的Ca2+在生命活动的维持、生长、发育、衰老和死亡等众多生物学过程中都发挥着重要的调控作用。这样一种简单的离子之所以能精确调控细胞内各种不同甚至相反的生理活动，是由于胞内自由Ca2+水平的变化(即钙信号)具有高度的时空特异性。在时间尺度上，钙信号不同的持续时间、发生频率介导了不同的生理反应[1]，例如微秒、毫秒范围的胞吞胞吐和肌肉收缩，数分钟乃至数小时的细胞代谢，甚至于数年累月的生长过程等。瞬时的钙信号可能只影响某些酶促反应或是膜通道的开关，而时间跨度更长的钙信号则可能引起基因的转录和蛋白质的翻译等。在空间维度上，局部的钙火花与传导整个细胞的钙波也会引发不同的反应。例如质膜区域附近的钙信号既可以局部地激活下游信号分子，也可以传递至细胞深处发挥作用。但由于胞浆中存在大量的钙螯合蛋白质，Ca2+的扩散距离有限，需要借助内质网上的钙通道以“钙致钙释放”(Ca2+induced Ca2+release, CICR)来产生能长距离传播的钙波。内质网在该过程中发挥整合调节的作用，将低于CICR阈值的钙信号中止，而将阈上刺激信号放大并产生钙波，从而造成不同的结果。除了时空上的差异，钙信号的幅度也影响着细胞产生不同的效应。

胞内的游离Ca2+浓度受到细胞精确的调控。在正常状态下，细胞内Ca2+水平处于相对稳定的动态平衡状态，即钙稳态。静息Ca2+水平的异常增高或降低(即钙稳态的失衡)会导致细胞功能的失调，甚至引起细胞的死亡。许多人类疾病都与之息息相关，例如心血管疾病、免疫缺陷疾病和癌症等[2]。目前越来越多的证据表明，在神经退行性疾病例如阿尔茨海默病中，神经元的钙稳态也是失调的[3, 4]。阿尔茨海默病的发病率随居民的年龄增加而升高。随着我国老龄化进程的加深，该病症给社会带来了日益沉重的负担。但由于阿尔茨海默病确切的致病机制仍不清楚，临床上仍无特效药。因此，研究神经元Ca2+调控与阿尔茨海默病之间的关系，能促进对阿尔茨海默病致病机制的理解，为药物研发提供思路。

1 神经元钙信号系统

神经元是神经系统的基本单位，包含有树突、胞体、轴突以及神经元之间形成的突触结构等。神经元是典型的可兴奋性细胞，其诸多生理功能都受到钙信号的调节，例如动作电位的产生与传导、突触小泡的释放以及突触可塑性等。因此，钙信号系统是神经元信号系统中非常重要的组成部分。神经元钙信号有多种产生方式，大致可分为：胞外Ca2+内流、内质网的Ca2+释放以及由Ca2+释放引发的Ca2+内流等。

1.1 胞外Ca2+内流

神经元质膜上有许多可以介导钙内流的受体或通道。其中，由谷氨酸受体所介导的钙内流是神经元所较为特有的。谷氨酸受体主要在神经元或神经胶质细胞的质膜上表达，是大脑中含量最丰富的兴奋性神经递质受体，包括代谢型谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptors, mGluRs)与离子型谷氨酸受体(ionotropic glutamate receptors, iGluRs)。其中iGluRs是配体门控的离子通道，包括N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptors, NMDAR)、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid receptors, AMPAR)等[5]。iGluRs各种亚型以不同的方式介导钙信号。接受谷氨酸的刺激后，其中的AMPAR介导的Na+及Ca2+内流，引发细胞去极化。当细胞膜电位去极化达到一定阈值后，NMDAR释放通道中的阻断因子Mg2+，此时NMDAR便可与谷氨酸结合，引发钙内流(Fig.1A)。由于NMDAR与谷氨酸的亲和性远高于AMPAR，所以使细胞能够产生更持续的信号。AMPAR产生的电流信号持续10 ms，NMDAR产生的信号可达500 ms[6]，而mGluRs介导的信号时间尺度会更长。这些不同的谷氨酸受体亚型在同一神经元突触部位表达，使钙信号更具有时间上的特异性。

此外，神经元质膜上还具有兴奋性细胞特有的钙通道，例如电压门控的钙通道(voltage gated calcium channels，VGCC)等。这类通道能被神经元膜电位的去极化激活而引发钙内流[7]。

神经元质膜上还有许多哺乳动物细胞中普遍存在的非选择性离子通道。其中的瞬时受体电位(transient receptor potential, TRP)通道，能介导包括Ca2+在内的阳离子内流[8]。近年来发现的对神经元兴奋性有重要的调节作用的钙稳态调节子(calcium homeostasis modulator, CALHM1)，则可以被质膜去极化或胞外Ca2+浓度降低而激活，介导包括Ca2+与ATP等分子的内流[9]。此外，新近发现的机械敏感性的Piezo通道及OSCA/TMEM63通道，也可在质膜上介导钙内流[10, 11]。

1.2 内质网Ca2+释放

胞内钙信号的另一来源是内质网中Ca2+的释放(Fig.1A)。从胞体、轴突到末端的神经棘突，内质网几乎遍布整个神经元。静息状态下，内质网内含有亚毫摩尔水平的游离Ca2+，所以内质网也被称为细胞的钙库。一直以来，人们普遍认为内质网是一个均质性的钙库，但也有研究认为可能存在钙释放通道特异性的独立钙池[12]。内质网上主要有2种钙释放通道，分别是1,4,5-三磷酸肌醇受体(inositol 1，4，5-trisphosphate receptors，IP3R)和兰尼碱受体(ryanodine receptors，RYR)。

神经元在受到多种刺激后会间接的通过上述2种通道引发钙释放。例如，在神经元中高表达的谷氨酸受体除了能介导钙内流外，还可以介导钙释放。谷氨酸受体中的mGluRs主要为G蛋白耦联受体。这类受体在被谷氨酸激活后，可以诱导产生1,4,5-三磷酸肌醇(inositol 1，4，5-trisphosphate，IP3)，后者结合并激活IP3R引发钙释放。另外，神经元质膜在受到刺激去极化后会激活VGCC引发钙内流，这一钙信号在达到阈值后会直接激活IP3Rs或RYRs。这两者进而介导钙释放，引发更大的钙信号。但如果钙内流或以其他方式产生的胞浆钙信号过高时，IP3Rs或RYRs的功能反而被抑制。这种胞浆钙水平对IP3Rs或RYRs的双重调控是细胞产生钙波或者钙振荡的关键。除Ca2+外，内质网上的钙释放通道还受到多种因素的调控，IP3、咖啡因可分别增加IP3R和RYR对Ca2+的敏感性，进而可以用更小的胞浆钙信号来激活IP3R或RYR，产生钙释放。

1.3 内质网Ca2+释放引发的Ca2+内流

在神经元中，上述去极化或谷氨酸等引发的钙释放会导致内质网钙水平下降。为此，细胞进化出一种通过内质网膜与质膜的互作来介导的钙信号通路(Fig.1B)。内质网膜与质膜之间部分区域的距离非常近，小于30 nm，被称为内质网与质膜区域的膜接触点(membrane contact sites, MCSs)，也称内质网-质膜连接区。在这些膜接触点区域，富集有多种蛋白质，对局部钙信号的形成非常关键，对神经元的兴奋性有重要的调节作用。其中内质网膜上的基质相互作用分子(stromal interaction molecule, STIM)蛋白与质膜上的Orai钙通道蛋白，在内质网钙水平降低后，会组装成有活性的钙释放激活的钙(Ca2+release activated Ca2+, CRAC)通道，介导内质网与质膜的互作并引发钙内流。这一现象称为钙池操纵性钙内流(store operated calcium entry, SOCE)[13]。静息时，STIM蛋白位于内质网腔侧的EF-SAM区结合有Ca2+，而当内质网钙水平下降时，Ca2+从该区解离出来，引发后者的构象变化，并暴露出其中的疏水基团，进而使得STIM内质网区发生二聚化。这一构象变化通过STIM跨膜区的传递，使得STIM胞浆区域卷曲的构象变得较为伸展。胞浆区中STIM激活Orai的最小片段(the STIM1 Orai activating region, SOAR)，因而从内质网膜附近移动到更靠近质膜的位置，结合并激活质膜上的Orai，引发钙内流，即SOCE[14]。

SOCE曾经被认为是非兴奋性细胞所特有的生物学过程。而如今大量研究表明，SOCE通路在神经元中普遍存在，并发挥着关键作用[15-17]。经典的钙释放激活的钙信号由STIM与Orai介导。STIM蛋白的两种亚型，STIM1和STIM2，在脑中均有表达。STIM1主要分布于小脑，特别是浦肯野神经元中[15]，STIM2则主要表达在海马区以及皮质神经元中[18]。STIM1与STIM2的一级结构具有很高的同源性，但在功能上则略有差异。STIM2相比于STIM1，在静息时，就已经处于半激活的状态，所以更容易感受到钙水平的变化[19]。但STIM2激活Orai1的效率却低于STIM1。过表达STIM2，会减小STIM1介导的SOCE[20]。Orai在哺乳动物中有3种不同的同源蛋白质：Orai1、Orai2以及Orai3，均以六聚体的形式发挥功能。大脑中，3种Orai蛋白质的分布有所区别，Orai1在小鼠皮质神经元中表达较多，与STIM2有较强的相互作用[21]，Orai2则在海马以及小脑中显著表达[22]。目前有研究认为，3种Orai蛋白质介导的钙内流大小不同，从而引发不同的下游事件[23]。

神经元在产生钙信号的同时，也会激活一系列的Ca2+清除机制：内质网钙泵(sarco/endoplasmic reticulum calcium transport ATPase, SERCA)将胞浆中的Ca2+泵回内质网，质膜钙泵(plasma membrane Ca2+-ATPase, PMCA)、钠/钙交换体(Na+/Ca2+exchanger，NCX)等将Ca2+排出胞外，从而使得胞内各部位的Ca2+浓度很快回到静息水平。这种精确的调控使神经元的钙水平处于相对稳定的动态平衡中，即为钙稳态。钙稳态是神经元正常生理功能的基础。无论是钙信号的产生还是清除，一旦发生失调都会打破这种稳态，导致神经元的生理功能的异常，甚至引发细胞凋亡。

2 神经元钙信号的功能

Ca2+对神经元的兴奋性发挥关键的调节作用。首先，胞内Ca2+能激活多种钙依赖性离子通道来改变细胞膜电位，进而影响神经元的兴奋性。当神经元受到外界刺激而发生去极化时，Ca2+通过质膜上VGCC进入细胞，激活钾通道gKCa1，能够促进膜的复极化。而当电位降至静息状态时，gKCa1还未关闭，细胞进一步发生超极化。这种超极化会在100 ～ 200 ms内恢复至静息电位，而被称为快速的后超极化(fast after-hyperpolarizations, fAHPs)。不仅如此，钙内流还会引发内质网钙释放。这一钙信号会激活gKCa2的开放，而产生缓慢的后超极化(slow after-hyperpolarizations, sAHPs)。此外，Ca2+还可以通过影响钙依赖性Cl-通道，调控神经元兴奋性[24]。其次，钙依赖性神经递质的释放对于神经元之间兴奋性的传递是至关重要的。其中，Ca2+部分来源于VGCC介导的钙内流，部分来源于内质网的钙释放。因此，内质网钙稳态的维持对于神经递质的释放调节十分必要[25]。

神经元突触区域钙水平的变化不仅影响神经递质的释放，还对突触的可塑性有关键的调节作用。1973年，Bliss等[26]发现，当给予海马内嗅皮层到齿状回的神经通路一连串强直刺激，会导致齿状回神经元兴奋性突触电位(excitatory postsynaptic potential, EPSP)幅度增加，可以持续数小时甚至数天。这现象被称为长时程增强(long term potentiation, LTP)。当用低频刺激通路，则引起场电位幅度减小，称为长时程抑制(long term depression, LTD)[27]。LTP和LTD都依赖局部升高的钙信号。但所依赖的钙信号幅度不同，长时程增强依赖高幅度的钙信号，而稍小的信号，例如突触区域300 ～ 500 nmol/L钙信号，则引发长时程抑制。长时程增强通常对应着突触形态上的改变，例如树突棘的生长、AMPA受体的磷酸化等，长时程抑制则与之相反。这些由外界重复刺激造成的突触结构和功能的改变，被称为突触可塑性。突触可塑性是学习与记忆的基础。其中，长时程增强可以分为早期(early-LTP, E-LTP)和晚期(late-LTP, L-LTP)。E-LTP需要1 s 100 Hz的刺激，而L-LTP需要的10 min 间隔的3次以上的重复刺激。有研究认为，E-LTP过程中，胞外Ca2+进入细胞后，被泵进内质网，使得内质网钙水平增加，影响了IP3R和RYR对Ca2+的敏感性，因而下一次相同幅度的刺激会引发更大幅度的钙信号反应，从而形成一种类似“记忆”的信息。E-LTP持续时间在1 h以内，L-LTP持续的时间更长，则涉及到基因的转录以及蛋白质的合成等。

Ca2+还可以通过多种钙依赖通路所介导的基因转录来长时程的调控神经元的活动(Fig.1C)。其中，Ca2+从胞外进入细胞的方式不同，激活的信号通路则不同。由VGCC介导的钙信号一方面可以激活腺苷酸环化酶产生环腺苷酸(cyclic AMP, cAMP)。cAMP本身既可以入核，也会引发蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)入核。另一方面，Ca2+还能激活钙调蛋白，使其入核后激活钙/钙调蛋白依赖性激酶(calcium/calmodulin-dependent protein kinases, CaMKs)。进入细胞核内的cAMP、PKA以及CaMKs会磷酸化转录因子，例如环腺苷酸效应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein, CREB)，引发基因转录[28]。而由TRP通道介导的钙信号，则通常促进转录因子NF-κB入核[29]。由Orai通道进入细胞的钙信号，则通过钙调神经磷酸酶作用于活化的T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells, NFAT)，使其去磷酸化，进入细胞核启动基因表达。此外，L型钙通道、NMDAR介导的钙内流也可激活NFAT的入核。这些基因的表达和蛋白质的合成，对树突棘、神经轴突的生长、神经元的发育以及突触可塑性等方面有重要的影响[30, 31]。使用SOCE抑制剂，例如2-APB或SKF96365等，能使神经元长时程增强减弱，对突触可塑性造成损伤[32]。除了上述方式，Ca2+本身也能以钙波的方式入核激活CREB等转录因子。

Fig.1 Diagram showing neural Ca2+ signaling system (A) Synaptic Ca2+ signals: Ca2+ influxes from extracellular space through VGCC, NMDAR, AMPARs or mGluRs and Ca2+ releases from ER mediated by IP3Rs or RYRs. (B) SOCE at ER-PM junctions: SOCE is triggered by lowering of ER Ca2+ level, mediated by CRAC channels that are composed by ER Ca2+-sensors STIM, and the pore-forming unit Orai. (C) Ca2+-dependent gene expression: Cytosolic Ca2+ signals may activate different transcription factors like calcineurin-NFAT, NF-κB, and cAMP-CREB, leading to changes in gene expression. VGCC, voltage gated calcium channels; NMDAR, N-methyl-D-aspartate receptor; AMPAR, α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid receptor; IP3R, Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor; RYR, Ryanodine receptor; SOCE, store-operated Ca2+ entry; STIM, stromal interaction molecule; NFAT, nuclear factor of activated T cells; cAMP, cyclic AMP; CREB, cAMP response element binding protein; gray solid lines, direction of movements; gray dashed lines, effects on targets

3 神经元钙稳态失衡与阿尔茨海默病

神经元正常生理功能的维持、记忆与遗忘都与神经元钙稳态息息相关。神经元钙稳态失衡与包括阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)在内的多种疾病高度相关。AD是一种为人所熟知的神经退行性疾病。2015年，世界范围内AD患者已达4 600万。据预测，在未来20年内，患者人数将达1亿人次[33]。从1906年AD被报道至今，相关研究持续百余年。AD患者临床表现为记忆的丧失与认知功能的障碍，病理上表现为脑内出现β-淀粉样肽(β-amyloid，Aβ)沉积为核心形成的老年斑、Tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)以及神经元丢失等。根据百年来的研究，对AD的病因提出了多种假说，包括Aβ毒性假说、Tau蛋白假说、遗传变异假说等。其中，Aβ毒性假说主要认为，淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)经分泌酶异常切割后，产生的含42个氨基酸的肽段Aβ42，易聚集形成具有神经毒性的斑块状沉淀，可造成神经元损伤，最终导致AD的发生。而Tau蛋白假说则认为，神经元中Tau蛋白的过度磷酸化是导致AD产生的重要因素。Tau蛋白是细胞内调节微管稳定性的一种微管相关蛋白质。其过度磷酸化，一方面会促使微管解聚，破坏细胞骨架，另一方面易聚集成双螺旋丝，形成NFTs，对神经元造成损伤。遗传变异假说则认为，AD的产生主要与APP、早老素1(presenilin1，PSEN1)和早老素2(presenilin2，PSEN2)等基因的突变有关。这3种基因编码的蛋白质都参与Aβ的形成，若发生突变，易导致Aβ的异常增多或者易聚集的Aβ42生成，从而过度累积形成斑块[34]。这些假说为AD药物的研发提供了思路。但可惜的是，基于这些假说研发的AD的治疗药物，在临床实验阶段均以失败告终。因而目前仍未找到AD确切的发病机制。对于Aβ的积累、Tau蛋白的过度磷酸化等现象究竟是原因还是结果仍无定论。所以近年来提出一些新的假说，希望能更好地解释AD的病理过程。

近些年的研究发现，钙稳态的失衡与AD的发生发展有着密切的关系，即AD的“钙假说(calcium hypothesis)”。钙假说起源于1970 s年代末对大脑衰老的研究，于1984年由Khachaturian 正式提出[35]。该假说认为，神经元钙稳态调节机制的持续性改变对神经元功能失常，大脑慢性疾病的发生发挥重要作用。三十多年来，钙假说获得了越来越多的实验及病理证据的支持[36-38]。

3.1 胞浆钙稳态失衡与AD

研究者首先发现，AD患者神经元胞浆静息钙水平相对于正常水平而言显著增高，这一现象可能由多种因素造成。按Ca2+的来源不同，可分为4类：胞外钙内流增加、内质网钙释放增加、胞浆钙鳌合蛋白的减少和钙外排减少(Fig.2)。

当前，对AD中胞外钙内流是否增加仍存在一定的争议。部分研究者认为，钙内流减少，例如Thibault等[39]在2xTg AD小鼠中发现，CA1区域神经元的L型钙通道电流相比于野生型减小，以及Eric Snyder等认为，Aβ增加了NMDAR内吞作用，使质膜上NMDAR的含量减少。Dreses-Werringloer等[40]发现，晚发型AD型病人中，CALHM1 位点多态性(P86 L)，减弱了Ca2+的渗透率，对APP的代谢造成影响。但以上结果并不受到大部分研究的支持。如有些研究认为，CALHM1多态性(P86 L)与晚发型AD并不存在必然联系。全细胞膜片钳研究显示，在12～16个月大老年3xTg-AD小鼠(过表达Tau (P301 L)，APP (SWE) 和 PSEN 1 (M146V)3种突变基因)的海马CA1神经元中，L型钙通道介导的钙内流增加，使得CA1神经元更易受损[41]。除此之外，另有一些研究认为，NMDAR介导的钙内流增加[42]。目前，市场上缓解AD症状的药物美金刚(Memantine)就是一种 NMDAR拮抗剂，可以抑制NMDAR的过度激活[43]。另有报道认为，Aβ本身也可在膜上形成钙渗透通道[44]，或是作用于质膜上的受体，引发钙内流。而在HEK293细胞中，过表达PSEN2突变(D263A)，会增加通过TRPC6进入细胞的钙内流大小。因此，众多研究结果更支持胞外钙内流增加的理论。

当前，对AD模型中钙内流变化虽有争议，但对内质网Ca2+释放增加的观点则接受度较高。Aβ可通过作用膜上的mGluR5，产生更多的IP3[45]，进而使IP3R受体介导钙释放增加。家族型阿尔兹海默症(familial Alzheimer’s Disease; FAD)相关PSEN突变中，内质网钙释放通道表达增加[46]，活性增强[47]，对配体更敏感[48]，使得钙释放增加。RYR拮抗剂Dantrolene在3xTg AD小鼠中也展示出神经保护性[49]。

另有研究发现，AD模型中，神经元胞浆中的Ca2+结合蛋白(calcium binding protein, CaBP)表达量下调。Ca2+结合蛋白对神经元有保护作用，大脑中不同区域Ca2+结合蛋白的表达变化会导致神经元更易受损[50]。AD病人基底前脑胆碱能神经元中，CaBP表达显著下降与胆碱能神经元的丢失有关[51]。

除此之外，研究发现，Aβ可直接作用于在质膜上的PMCA[52]，影响Ca2+的外排途径。在AD动物模型的海马CA1区，钠/钙交换体的表达量也显著下降[53]。

综上，在多种因素影响下，AD患者神经元胞浆静息钙水平显著上升。胞浆静息钙水平上升会激活多种钙相关的酶类，例如钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶2 (calcium/calmodulin dependent protein kinase kinase Ⅱ, CAMKKⅡ)，CAMKKⅡ会激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)，活化的AMPK作用于Tau蛋白的S262/S356位点，促进Tau蛋白的磷酸化。另外，有些研究认为，Ca2+能通过激活CaMKII磷酸化APP，从而促进Aβ的形成[54]，造成神经毒性[55]。另外，CaMKII还可磷酸化AMPAR[56]，或与NMDAR结合。CaMKII与NMDAR结合形成的复合物对长时程增强的形成有重要的作用。CaMKII活性的异常，影响了神经元突触的生理功能以及记忆的形成与巩固[57]。此外，钙调磷酸酶(calcineurin, CaN)能作用于磷酸化的NFAT或CREB，使其去磷酸化，从而影响基因的转录；或是去磷酸化糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)，造成Tau的过度磷酸化[58]。钙调蛋白以及钙依赖性蛋白酶类作为Ca2+的下游靶点，承担着执行者的功能。总之，胞浆钙稳态的改变会导致其靶蛋白质活性的异常，进而造成了细胞功能上的失调[59]。

3.2 内质网钙稳态失衡与AD

目前，对于AD病程中内质网钙稳态是否发生改变等问题仍存在一定的争议。支持内质网钙水平上升假说主要有以下的间接证据：PSEN1可与SERCA发生互作，增强SERCA往内质网中泵钙的能力[60]。另外，位于内质网膜上的PSEN被认为是一种可通透阳离子的低电导率通道，允许Ca2+被动漏出内质网。当PSEN发生突变，钙漏通道受阻。因此，Ca2+被留滞在内质网中，进而增加内质网静息钙水平[61]。但最近的一些直接检测结果则支持相反的结论。研究者发现，FAD相关的PSEN突变不改变或者降低了内质网的钙水平[62-64]。Brunello等[65]用定位于内质网的钙指示剂ER-Aequorin检测PSEN2突变的细胞，发现内质网钙水平减小，SERCA被抑制，钙释放增加。McCombs 等[66]用D1ER检测PSEN敲除细胞以及PSEN突变细胞的内质网钙水平，发现不同PSEN1突变会造成内质网钙水平发生不同变化，PSEN1(V94 M)使内质网钙水平升高，PSEN1(M233V、A409T)使钙水平下降。

当前，之所以存在对AD细胞中内质网钙水平变化的争议，主要是有下述几种原因。首先，可能不同的PSEN亚型，或同一种PSEN不同的突变位点本身对内质网钙水平造成了不一样的影响。其次，可能是研究方法不同造成的假象。定位于内质网的钙指示剂相较于胞浆钙指示剂而言，发展更晚，所以早期研究主要使用定位于胞浆的钙指示剂，通过检测药物清空内质网钙库引发的钙释放的大小，来间接指示钙库的大小。但这种间接测量的结果易受多种因素的干扰，例如钙指示剂的灵敏度，钙库清空的程度，以及质膜上PMCA或NCX的影响等。而利用内质网定位的钙指示剂进行直接检测的方法也存在一定的缺陷。首先，单色的钙指示剂，例如ER-aequorin信号受指示剂表达量的影响，无法直接指示静息钙水平。为了能抵消掉指示剂浓度不同所造成的荧光信号的差异，需要双色的比值型钙指示剂，例如D1ER，GEM-CEPIA1er等。其次，内质网静息钙浓度较高，需要低钙亲和性的指示剂，但多数内质网钙指示剂的亲和力都不够低，因而对较小的内质网钙水平变化不够敏感。另外，多数指示剂本身的动态变化范围不够大，难以指示较小的钙水平变化。除此之外，还有一些实际使用问题，例如Mag-Fura-2，测量时需要通透细胞，而这个操作本身可能会改变内质网钙水平。GEM-CEPIA1er等用紫外激发的钙指示剂在使用时，具有光毒性，无法对钙稳态进行长期检测。因此，近年来用内质网钙指示剂，例如D1ER、D4ER等直接检测PSEN突变细胞的内质网钙水平，获得了不同的结果。目前，仍不清楚造成这些争议的原因是方法工具本身的局限，还是机制本身。为解决这些争议问题，亟需开发新的内质网钙指示工具。最近，我们对高灵敏、高动态范围的单色CEPIA1er进行了改造，获得了可见光激发的比值型内质网钙指示剂miGer[67]。如能将该指示剂应用于AD相关研究，则有望能解决上述争议问题。

STIM和Orai介导的SOCE通路是一种重要的钙信号产生和内质网钙稳态维持机制[68]。近年来，许多研究证明，SOCE对神经元突触的功能有重要作用[69, 70]。在浦肯野神经元中敲除STIM1后，能通过影响mGluR1介导的钙信号，进而影响神经递质的传递以及下游基因的转录[71]。在AD相关模型中也发现存在SOCE减弱的现象[72, 73]。在FAD病人的外周血B淋巴细胞、散发型AD病人皮质神经元以及PSEN1突变(M146V)的小鼠海马神经元中，均发现SOCE下调，STIM2的表达量下降，突触区域的棘突减少等现象[30, 74]。在表达APP的小鼠中，也存在同样的情况。神经元SOCE的下调，通过降低CaMKII酶的活性，抑制了突触的生长与突触可塑性，从而影响长时程增强的产生[75]。通过超表达STIM2[76, 77]，或添加一种增强SOCE的新型调节因子NSN21778[78]，均能缓解FAD模型中海马神经元突触棘突损失的现象，降低Aβ对神经元造成的毒害作用。Kyung等[79]利用光遗传学工具OptoSTIM1介导的钙信号，增强了小鼠形成背景记忆的能力，暗示光激活的CRAC信号在AD干预中的应用潜力。而我们与合作者等通过单元件的光激活CRAC通道LOCa3，缓解了AD模型果蝇爬行能力的衰退[80]。上述结果均表明，SOCE相关通路可以作为AD的一种潜在治疗靶点。

3.3 线粒体钙稳态失衡与AD

线粒体作为细胞产生能量的重要细胞器，在Ca2+调节方面也发挥着类似于钙螯合剂的作用。当胞浆中的钙水平上升时，线粒体通过线粒体Ca2+转运体(mitochondrial calcium uniporter, MCU)摄取到线粒体基质的Ca2+也增多。线粒体摄取的Ca2+除来源于胞浆外，更多地来源于内质网。研究发现，AD模型神经元中或AD病人的成纤维细胞中，内质网与线粒体的联系加强。线粒体相关内质网膜(mitochondria-associated ER membrane, MAM)的形成增加[81]。内质网膜上PSEN的分布并不是均匀的，而是富集于MAM区[82]。过表达PSEN2或是Aβ，能增加钙从内质网向线粒体的传递[83, 84]。生理条件下，线粒体正常功能的维持，例如氧化磷酸化等能量产生反应，需要合适浓度的Ca2+。但在AD模型中，线粒体摄取过多的Ca2+，反而抑制了氧化磷酸化反应，影响ATP的产生，同时产生过多的活性氧(reactive oxygen species, ROS)。ROS上具有不成对的电子，被释放到胞浆后对细胞有很强的攻击作用，可引发链式反应，造成膜结构的崩解，或者进入细胞核破坏DNA结构，引起细胞的凋亡。另外，钙过载会导致线粒体通透性转运孔(mitochondrial permeability transition pore, mPTP)的开放。mPTP是一种非选择性通道，其异常开放会过多地释放Ca2+、ROS、NAD+和细胞色素c等近百种物质。细胞色素c也是引发凋亡的另一关键因子。同时，细胞色素c还能作用于内质网的IP3R上，进一步促进Ca2+释放，使细胞的钙超载程度进一步加深(Fig.2)。神经元突触部分的线粒体含量较多，为突触小泡的运输和释放提供能量。当线粒体Ca2+超载，线粒体的功能失调，则突触的功能也随之受损，进而影响神经元之间的交流[85]。

Fig.2 Ca2+ hypothesis of AD Major known pathways that lead to loss of Ca2+ homeostasis occurring in AD models. 1) Reduced STIM expression and impaired SOCE. 2) Mutations in PSEN or APP and accumulation of Aβ oligomers that may enhance Ca2+ entry, facilitate ER Ca2+ release, or inhibit Ca2+ clearance. These changes increase resting cytosolic Ca2+ levels, promoting aggregation of Aβ and phosphorylation of Tau. 3) Mitochondria Ca2+ overload caused by upregulated ER-mitochondria Ca2+ cross talk. This overload may lead to enhanced generation of ROS, opening of the mPTP, and releases of Cytochrome C, prompting apoptosis. AD, Alzheimer’s disease; PSEN, presenilin; APP, amyloid precursor protein; Aβ, amyloid β; ROS, reactive oxygen species; mPTP, mitochondrial permeability transition pore. Orange solid lines, increased calcium flow; orange dashed lines, decreased calcium flow; gray solid lines, direct effects; gray dashed lines, indirect effects

4 问题与展望

钙信号对于神经元生理功能的维持发挥关键的作用，因而受到极为精确的调控。神经元钙信号的异常以及钙稳态的失衡，会造成神经元功能的失调，甚至引起神经元的凋亡。多项研究表明，神经退行性疾病例如阿尔茨海默病与神经元钙稳态的失衡，特别是胞浆钙水平增高密切相关，由此产生了AD的钙假说。尽管目前该假说的内容仍不够完善，还存在着如“神经元中内质网钙水平是否变化以及钙稳态失衡究竟是导致AD发生的原因，还是AD造成的结果”等悬而未决的问题。但这一系列问题有望随着新兴技术的发展而得到解析。利用更灵敏的钙指示剂可获得关于AD神经元细胞器钙稳态更精准的信息。另外，通过引入光遗传学工具等时空特异性更高的手段来操控细胞内的钙信号，则有望解析钙稳态及钙信号在AD中的作用机制。在对AD与神经元钙稳态的联系有了更准确的认识后，神经元的钙水平有望成为AD新的检测指标，钙信号通路及相关蛋白质也可能成为潜在的AD药物靶标。

对钙假说的完善，除了需要理清争议性内容并进一步解析未知的机制之外，还需要不断探寻钙假说与其他AD假说之间的联系。因为钙假说不是孤立存在的，它与其他AD假说之间存在着千丝万缕的联系。例如，Aβ在质膜上形成可通透Ca2+的通道，造成胞浆钙水平异常增高，而过高的钙水平既会进一步促进Aβ的产生，还会促进Tau蛋白的过度磷酸化等。这些工作将进一步完善钙假说，有助于更系统更全面地认识AD的病理机制，并为找到AD的有效治疗手段提供理论基础。