COMPASS核心成员Ash2l通过调控细胞周期影响神经祖细胞增殖

马孟杰， 彭小忠, 2) *， 舒鹏程 *

(1)中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 生物化学与分子生物学系 医学分子生物学国家重点实验室 医学灵长类研究中心 神经科学中心， 北京 100005；2)中国医学科学院 医学实验动物研究所， 北京 100021)

神经祖细胞(neural progenitor cells, NPCs)在哺乳动物新皮质发育过程中发挥核心的作用。在小鼠大脑皮质中，神经祖细胞主要分为两类，一类是位于脑室周区(ventricular zone，VZ)的放射状胶质细胞(radial glial cells，RGCs)，另一类是位于脑室下区(subventricular zone，SVZ)的中间神经前体细胞(intermediate progenitor cells，IPs)，二者都具有增殖和分化成神经元的潜能，但具有不一样的特性[1]。RGCs是其中最主要的神经祖细胞，既可通过对称分裂生成2个相同的RGCs维持神经祖细胞的数量，还可以通过不对称分裂，产生IPs以及神经元[2]。而且，RGCs具有另外1个标志性特征是其细胞核会沿着顶-底轴(apical-basal axis)动态迁移，也称为内部动态核迁移(interkinetic nuclear migration，INM)[3-5]。研究表明，INM与RGCs细胞周期进程以及调控细胞接受信号有关。其中，M期细胞核沿着室周排布，而S期细胞核主要位于基底(basal)侧[6-8]。但是，目前对于INM的调控机制仍了解较少。

发育过程中基因表达受到各层次的调控，包括转录水平，翻译水平和翻译后水平等。表观遗传调控在基因表达调控中的作用已被众多研究证明。其中，组蛋白修饰是表观遗传调控的重要组成部分。组蛋白二价修饰，即特定基因组位点同时存在H3K4me3和H3K27me3修饰，在大脑皮层发育中发挥至关重要的作用[9]。单独的H3K4me3修饰与基因表达成正相关。在哺乳动物细胞中，H3K4me3修饰主要由蛋白质复合体介导，称为COMPASS(complex of proteins associated with Set1, COMPASS)复合体[10]。

ASH2L(absent, small, or homeotic 2-like)是COMPASS复合体的核心成员之一，参与复合体对组蛋白H3K4甲基化修饰，从而调控相应基因的表达[11,12]。Ash2l基因在物种间具有高度保守性[13]。本实验室于2001年首次克隆得到人源Ash2l序列，并对其表达谱进行了分析。结果发现，ASH2L在胎儿肝、睾丸等器官中高表达，并且对造血细胞过程和特定白血病的形成具有调节作用[14]。2019年，有研究证实，在造血干细胞中敲除Ash2l之后会影响造血干细胞的细胞周期和增殖能力[15]。在神经系统的研究中，Ash2l被预测为尼古丁暴露所致的皮质神经元发育不良的靶标分子，它参与调控神经元的树突棘的形成[16]。最新的临床研究表明，受母亲孕期吸烟的行为影响的后代中，Ash2l表达水平与正常相比，呈现出显著的表达差异[17]。ASH2L主要的生物学功能是参与组蛋白甲基转移酶复合体的组装，辅助组蛋白甲基转移酶发挥功能，激活下游基因转录，调节个体发育、细胞分化、代谢和肿瘤抑制等作用[18,19]。另外，ASH2L被认为对维持细胞整体H3K4甲基化水平具有关键的作用[11]。

以往的研究结果表明，在小鼠大脑皮质中特异性敲除Ash2l严重影响大脑皮质的发育，尤其是浅层神经元的生成[20]。我们进一步探索了Ash2l对NPCs细胞周期的调控，明确了缺失Ash2l导致大脑皮质发育异常的原因，包括NPCs空间分布的异常和细胞周期阻滞。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物： Ash2lfl/fl小鼠委托北京百奥赛图生物公司构建，D6-Cre工具小鼠由美国耶鲁大学钟伟民教授惠赠。

1.1.2 主要试剂： 氯化钠 (生工生物工程：A501218)，氯化钾 (Dimond：A100395)，氯化镁 (M2670)，磷酸二氢钾 (BBI：A600445)，磷酸氢二钠 (BBI：A610404)，TritonX-100 (Chemical)，组织包埋剂 (Tissue-Tek：O.C.T. Compoud)，DAPI染色封片一体剂 (Sigma：F6057)。抗体：Anti-Cyclin A (Abcam：ab270940)、Anti-Pax6 (Covance：prb-278p)、Anti-Tbr2 (Thermo：14-4875-82)、Anti-pH3 (Covance：prb-278p)、Anti-BrdU (中杉金桥：ZM-0013)、Anti-Ki67 (Abcam：ab15580)，Alexa Fluor 488 山羊抗兔 (Molecular：CA-11008)、Alexa Fluor 594山羊抗小鼠 (Molecular：CA-11005)、Click-iT EdU Alexa Fluor 647 (Invitrogen：A32933)。

1.2 方法

1.2.1 在体EdU、BrdU双标记法 参考以往核酸类似物双标记法[21]，用EdU替换碘苷(iododeoxyuridine, IddU)。按照50 ～ 100 mg/kg比例，向怀孕的母鼠腹腔注射相应量的EdU，1.5 h之后注射等量的BrdU，0.5 h后处死孕鼠，取胚胎脑组织。

1.2.2 组织处理和免疫荧光 将收集的小鼠脑组织浸泡在足量的4% PFA中，4 ℃固定24 h，第2 d换成25%的蔗糖溶液，4 ℃脱水24 h，用O.C.T.包埋组织，存放于-80 ℃。用组织冰冻切机，对脑组织进行冠状切片，每张厚度为16 μm，贴于载玻片上。

第1 d：将切片从-80 ℃冰箱中取出，恢复至室温，50 ℃烘箱，烤片30 min。此步骤可防止发生脱片。用0.5% Triton X-100缓冲液稀释绵羊血清至5% 浓度，室温孵育1 h，封闭切片上非特异性抗原位点。再孵育一抗 (稀释比例1∶100 ～ 1∶1 000)，4 ℃过夜。BrdU染色前,需要用2N HCl处理组织30 min，1 ×PBS洗3次,之后再用封闭液封闭非特异抗原位点。

第2 d：将切片用1×PBS洗3次，根据一抗的来源选择相应的二抗 (稀释比例为1∶1 000)，室温孵育2 h，1 × PBS洗3次，用DAPI封片。EdU染色应在蛋白质抗体孵育完二抗之后，室温1 ～ 3 h均可。

第3 d：使用Zeiss LSM780激光共聚焦显微镜拍照。

1.2.3 大脑皮质蛋白质提取及Western印迹检测 将所获得胚胎小鼠的大脑皮质暴露在视野中，用眼科镊夹取两侧大脑半球的脑皮层，放置于1.5 mL离心管中，立即将离心管放入液氮，防止蛋白质发生降解。用枪头将组织吹打混匀至匀浆状，冰上裂解30 min，低温高速离心提取脑组织蛋白质，-80 ℃保存用于Western 印迹检测。

配制10% SDS-PAGE分离胶和5% SDS-PAGE浓缩胶，将收集的蛋白质样品进行电泳。电泳结束后，将蛋白质通过半干转方式转移到硝酸纤维素(NC)膜上。再用TBST配制的5%脱脂牛奶室温封闭1 h，直接4 ℃过夜孵育一抗。孵育结束，取NC膜，在TBST中洗3次，每次5 min。随后，孵育对应源二抗，室温孵育1.5 h。二抗孵育结束，TBST洗膜3次，每次5 min，随后进行曝光。以β-肌动蛋白(β-actin)为内参，确定蛋白质的相对含量用于分析。

1.2.4 神经祖细胞数量统计 利用Adobe Photoshop (PS)软件的计数功能，对脑组织切片染色结果进行细胞计数，图中目的抗体染色阳性且与DAPI重合的点为1个阳性细胞，每组统计结果均分别计数了3对染色结果。

1.2.5 统计学方法 本研究所有实验均收集3对样品进行检测，用Graphpad Prism分析各组Mean ±SD，采用t检验进行统计检验，P<0.05标记为“*”；P<0.01标记为“**”；P<0.001标记为“***”。

2 结果

2.1 敲除Ash2l的神经祖细胞的数量和增殖能力降低、分布紊乱

在E16.5对照小鼠大脑皮质中，神经祖细胞包括分布于VZ区的RGCs(PAX6阳性)和分布于SVZ区的IPs(TBR2阳性)。Ash2l-cKO小鼠大脑皮质中的神经祖细胞数量减少，RGCs和IPs的P值分别0.0075和0.0016，并且RGCs和IPs分布出现紊乱(Fig. 1A)。30 min EdU插入实验显示，在对照组中，30 min内有大量的NPCs发生DNA复制，而Ash2l-cKO的神经祖细胞在30 min内几乎未见细胞发生DNA复制(P=0.0005)，说明NPCs的增殖能力严重受损(Fig. 1B)。另外，未发生DNA复制的神经祖细胞仍有许多是Ki67阳性，说明这些NPCs并未退出细胞周期，提示细胞周期可能发生了阻滞。

Fig.1 Ash2l knockout affected the number distribution and proliferation of NPCs (A) Co-labelling with RGC marker PAX6 and IP marker TBR2 to identify the number and distribution of NPCs and analysis of the number of RGCs and IPs per mm2. (B) Co-labelling with 30 minutes of EdU and the proliferating cell marker Ki67 and analysis of the number of EdU-positive cells per mm2. Scale bar=200 μm. n=3

2.2 Ash2l缺失使神经祖细胞 G2细胞周期蛋白A表达下调，M期的细胞核分布紊乱

增殖的RGCs存在内部动态核迁移现象(Fig. 2A)。RGCs形态修长并沿着顶-底轴分布。在细胞周期进程中，细胞核会沿此轴运动，当细胞核在贴近脑室的区域完成分裂(M期)之后，细胞核在G1期逐渐远离顶部区域向底部迁移，并在底部区完成DNA复制(S期)，接着细胞核于G2期时逐步迁移回到顶部区，最后在脑室区继续完成一次分裂(M期)。通过免疫荧光对大脑皮质神经元进行标记，利用M期的标注物 pH3观察神经祖细胞分裂的情况。结果显示，正常大脑皮质中，M期的NPCs细胞核会沿着VZ区排布，而Ash2l敲除后的细胞核分布位置散落在顶-底轴，并且沿着脑室排布的细胞数量显著减少，P=0.0003(Fig. 2B)，这说明Ash2l影响NPCs的M期的正常进程。进一步检测E16.5 d时,小鼠大脑皮质蛋白质表达情况(Fig. 2C)，发现Ash2l-cKO小鼠大脑皮质中G2期细胞周期蛋白A(cyclin A)表达下调。

Fig.2 Ash2l knockout affects cyclin expression and cell division in NPCs (A) The graphic diagram of RGC interkinetic nuclear migration. (B) Co-labelling with 30 minutes of EdU and pH3 and analysis the number of pH3-positive cells along the ventricle. (C) Detection the expression level of cyclin A in the Ash2l-cKO cerebral cortex. Scale bar=200 μm. n=3

2.3 Ash2l缺失的神经前体细胞S期长度缩短

Fig.3 The length of S phase is shortened in Ash2l-cKO NPCs (A) The strategy of EdU and BrdU double-labelling. (B) Left: Co-staining of EdU and BrdU in the cerebral cortex. Right: the S-phase length of NPCs. Scale bar=200 μm. n=3

3 讨论

在中枢神经系统(central nervous system，CNS)发育过程中，一直以来人们致力于解决神经干细胞细胞周期与细胞命运决定之间的关系。在对发育中的脊髓的研究发现，前神经因子(proneural)对脊髓动物神经发生发挥主要调节作用，Proneural家族编码具有helix-loop-helix (bHLH)基本结构的转录因子，包括Neuro G1/2/3[22]。在鸡胚神经管过表达Neuro G2，会导致神经前体细胞提早退出细胞周期，伴随着BrdU无法插入的表型[23]。进一步的机制研究表明，Neuro G2激活可导致周期调控蛋白亚型Cyclin D1/E1/E2/A2 表达量迅速减少。表型分析发现，细胞主要是阻滞在G1期，无法进入S期。并且，他们还揭示了细胞周期退出和细胞命运决定是两个独立的过程。在正常的发育过程中，Neuro G2负责紧密地协调这两个过程[24]。随着哺乳动物端脑皮层发育和神经发生，端脑VZ区的NPCs细胞周期长度会增加，尤其是G1期的长度[25]。通过不同的分子标志物区分神经前体细胞的亚群，人们发现G1长度增长与NPCs向IP转变有关。另外，主要功能是扩增干细胞数量的神经祖细胞，比命运为神经元的祖细胞拥有更长的S期[26]。

在背侧大脑皮层发育过程中，NPCs发挥决定性的作用。NPCs具有分裂、增殖和分化的能力，最终产生不同类型的子代神经元和神经胶质细胞。因此，NPCs稳态的维持是保证新皮层生理功能的先决条件，任何影响NPCs增殖、分化和命运决定的改变，都有可能损害NPCs稳态从而导致多种疾病，尤其是神经系统发育异常和肿瘤[27]。研究表明，随着神经发生，大脑VZ区的NPCs细胞周期长度会增加，尤其是G1期长度，而且细胞周期的调控对NPCs的命运决定具有重要作用[25,26]。在小鼠大脑皮质条件性敲除Ash2l之后，研究者发现，小鼠的大脑皮质发育严重受损，尤其是浅层神经元生成障碍，并发现细胞周期蛋白 D1表达下调，Cyclin E1表达上调，这证明了NPCs的G1期受到影响[20]。

本研究发现，在皮质神经元发育后期，Ash2l敲除小鼠大脑皮质中的两类NPCs排布紊乱，原分布在VZ区的RGCs减少，分布在SVZ区的IPs细胞核滞留在VZ区，结合30 min EdU插入异常，进一步说明了NPCs增殖能力下降。本研究在前人研究的基础上[21]，对实验方法进行了改进，并成功地证明Ash2l-cKO小鼠NPCs的S期长度缩短，细胞的DNA复制受到影响。另外，Cyclin A作为细胞周期G2期的蛋白质[28]，在大脑皮质中的表达量也出现了下调。最后，M期的NPCs细胞核分布紊乱，说明Ash2l敲除之后影响了RGCs细胞核迁移现象。因此，本研究提示了Ash2l可能是RGCs细胞INM过程形成的重要调控分子，为揭示RGC细胞INM的调控机制提供了新的线索。

综上所述，在Ash2l敲除鼠的大脑皮质中，NPCs的增殖能力减弱，细胞周期G1-S-G2-M各时期均受到严重的影响，进一步导致NPCs稳态失调，使NPCs不能按照既定的程序分裂、分化形成神经元，导致个体的脑皮质发育异常，皮质变薄，最终个体表现出不可逆的神经系统失调症，例如小头畸形、脑积水和癫痫等[20]。我们的工作对胚胎时期Ash2l表达改变所致的神经系统发育异常，进行了深层的原因探索，揭示了Ash2l在个体早期神经发育过程中的关键作用，为神经系统疾病的治疗提供新的线索和思路。

本研究仍存在许多不足之处。由于本研究所使用的工具鼠为D6-Cre，D6-Cre表达情况在个体之间存在差异，不同的敲除小鼠之间的敲除效率存在差异，导致表型严重程度不同[29]。另外，本研究尚未进行深入的分子机制研究。