中药饮片金银花、菊花微生物限度检查方法研究

尹良军，杨晓莉，王文娟，王宏杰

1.铜川市食品药品检验检测中心，陕西 铜川 727031；2.陕西省食品药品检验研究院，陕西 西安 710065；3.国家药品监督管理局药品微生物检测技术重点实验室，陕西 西安 710065

金银花为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或初开的花，药用历史悠久，是我国常见的中药之一［1-2］。金银花不仅在民间膳食中制作成酒和茶，还可作为药物、化妆品、观赏性花木等［3］。菊花是菊科菊属花卉菊的干燥头状花序。具有散风解热，平肝明目，清热利湿解毒的功能［4］。两者均可内服，煎汤，泡茶或入丸、散［5］。根据《中国药典》2020 年版四部直接口服及泡服饮片要求对金银花、菊花饮片微生物限度检查方法进行研究［4-7］。

1 仪器试药与菌株

1.1 仪器

电子天平（UX620H 型，日本岛津公司）；生化培养箱（SPX-150 型，扬州慧科电子）；电热恒温培养箱（WDP-9162 型，安亭科学仪器）；恒温恒湿培养箱（HWS-70D 型，杭州聚同电子）；电热恒温水浴锅（DKZ 型，常州忠旺仪器公司）；调速多用震荡器（HY-2 型，常州隆和制造有限公司）；高压蒸汽灭菌锅（LDZF-75KB-Ⅲ型，上海申安医疗器械公司）。

1.2 试药

金银花（陕西兴盛德药业有限公司生产，批号分别为20210108、20210303、20210502，产地均为河南）；菊花（陕西兴盛德药业有限公司生产，批号分别为20210101、20210302、20210303，产地均为浙江）。胰酪大豆胨液体培养基，批号：20 200720；胰酪大豆胨琼脂培养基，批号：20 200807；沙氏葡萄糖液体培养基，批号：20 210320；沙氏葡萄糖琼脂培养基，批号：20 200628；肠道菌增菌液体培养基，批号：20 201021；紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基，批号：20 210122；麦康凯液体培养基，批号：20 200713；麦康凯琼脂培养基，批号：20 200616；RV 沙门菌增菌液体培养基，批号：20 200613；木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基，批号：20 210310；培养基为青岛高科技工业园海博生物技术有限公司生产并进行了适用性检查；各培养基在使用前按照使用说明灭菌（煮沸）分装备用。

1.3 菌株

金黄色葡萄球菌（CMCC 26003）、铜绿假单胞菌（CMCC 10104）、枯草芽孢杆菌（CMCC 63501）、白色念珠菌（CMCC 98001）、黑曲霉（CMCC 98003）、大肠埃希菌（CMCC 44102）、沙门菌（CMCC 50094）均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

2 方法和结果

2.1 供试品溶液制备

取金银花10 g 置90 mL 胰酪大豆胨液体培养基振荡20 min，制成供试品溶液；称取菊花25 g 置225 mL胰酪大豆胨液体培养基振荡20 min，制成供试品溶液。供试品溶液用胰酪大豆胨液体培养基10 倍系列稀释。

2.2 菌液制备

需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数。按《中国药典》2020 年版四部方法试验：接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌至胰酪大豆胨液体培养基33 ℃培养18 h；接种白色念珠菌至沙氏葡萄糖液体培养基23 ℃培养72 h；用无菌氯化钠溶液稀释成每1 mL 小于104 cfu 的菌液。接种黑曲霉至沙氏葡萄糖琼脂培养基23 ℃培养72 h，加入浓度为0.05%（mL/mL）聚山梨酯80 的pH7.0 无菌NaCl溶液洗脱孢子，用无菌NaCl 溶液稀释成每1 mL 小于104cfu 的孢子液。用于活菌计数，备用。

控制菌：接种大肠埃希菌、沙门菌至胰酪大豆胨液体培养基上，33 ℃培养18 h，用无菌氯化钠溶液稀释成每1 mL 小于100 cfu 的菌悬液。

2.3 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验

2.3.1 需氧菌总数试验组取供试液加入5 个无菌试管中，每管加9.9 mL，再分别加入制备好的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉试验菌液0.1 mL。取1 mL 加入无菌平板，再加入胰酪大豆胨琼脂培养基。供试品对照组：取供试品溶液9.9 mL，加入pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液0.1 mL。取1 mL 加入无菌平板内再加入胰酪大豆胨琼脂培养基。菌液对照组：取胰酪大豆胨液体培养基分装于5 个无菌试管中，每管装量为9.9 mL，同试验组操作分别加入制备好的试验菌液0.1 mL。取1 mL加入无菌平板内再加入胰酪大豆胨琼脂培养基。空白对照组：无菌平板内加入胰酪大豆胨琼脂培养基。

2.3.2 霉菌和酵母菌总数试验组：取供试液加入2个无菌试管中，每管加9.9 mL，再分别加入制备好的白色念珠菌、黑曲霉试验菌液0.1 mL。取1 mL加入无菌平板，再加入沙氏葡萄糖琼脂培养基。供试品对照组：取供试品溶液9.9 mL，加入pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液0.1 mL。取1 mL 加入无菌平板内，再加入沙氏葡萄糖琼脂培养基。菌液对照组：取胰酪大豆胨液体培养基分装于2 个无菌试管中，每管装量为9.9 mL，同试验组操作分别加入制备好的试验菌液0.1 mL。取1 mL加入无菌平板内，再加入沙氏葡萄糖琼脂培养基。空白对照组：无菌平板内加入沙氏葡萄糖琼脂培养基。

试验菌的回收率=（试验组平均菌落数－供试品对照组平均菌落数）/菌液组平均菌落数。试验结果见表1，2。

表1 金银花需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数试验结果

表2 菊花需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数试验结果

金银花、菊花样品采用常规法，实验组平均菌落数减去供试品对照组平均菌落数的值与菌液组平均菌落数的比值均在0.5～2.0范围内，实验结果表明，常规法可用于检查需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数。

2.4 控制菌检查方法适用性试验

2.4.1 耐胆盐革兰阴性菌取“2.1”项下供试品溶液在23 ℃预培养2 h。

试验组：取供试品的培养物十倍系列稀释，各取1 mL 加入肠道菌增菌液体培养基中，33 ℃培养48 h后划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上33℃培养24 h。供试品对照组：取供试品的培养物十倍系列稀释，各取1 mL 加入肠道菌增菌液体培养基中，同时加入每1 mL 小于100 cfu 的大肠埃希菌试验菌液，33 ℃培养48 h 后划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上33 ℃培养24 h。菌液对照组：取肠道菌增菌液体培养基，加入每1 mL 小于100 cfu 的大肠埃希菌试验菌液。33 ℃培养48 h 后划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上33 ℃培养24 h。空白对照组：肠道菌增菌液体培养基33 ℃培养48 h 后划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上33 ℃培养24 h。

2.4.2 大肠埃希菌试验组：取“2.1”项下供试品溶液10 mL，加入100 mL 胰酪大豆胨液体培养基中，33 ℃培养24 h，取1 mL 接种至100 mL 麦康凯液体培养基中，43 ℃培养48 h，划线接种到麦康凯培养基平板上，33 ℃培养48 h。供试品对照组：取“2.1”项下供试品溶液10 mL，加入100 mL 胰酪大豆胨液体培养基中，同时加入每1 mL 小于100 cfu 的大肠埃希菌试验菌液，33 ℃培养24 h，取1 mL 接种至100 mL 麦康凯液体培养基中，43 ℃培养48 h，划线接种到麦康凯培养基平板上，33 ℃培养48 h。菌液对照组：取100 mL 胰酪大豆胨液体培养基，加入每1 mL 小于100 cfu 的大肠埃希菌试验菌液。33 ℃培养18 h，取1 mL 接种至100 mL 麦康凯液体培养基中，43 ℃培养24 h，划线接种到麦康凯培养基平板上，33 ℃培养24 h。空白对照组：取100 mL 胰酪大豆胨液体培养基，33 ℃培养24 h，取1 mL 接种至100 mL 麦康凯液体培养基中，43 ℃培养48 h，划线接种到麦康凯培养基平板上，33 ℃培养48 h。

2.4.3 沙门菌试验组取金银花、菊花各10 g 置90 mL胰酪大豆胨液体培养基中，混匀33 ℃培养24 h。取0.1 mL 接种至10 mL RV 沙门菌增菌液体培养基中，33 ℃培养24 h，划线接种到木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，33 ℃培养24 h。供试品对照组：精密称取金银花、菊花各10 g 置90 mL胰酪大豆胨液体培养基中，同时加入每1 mL 小于100 cfu 的沙门菌试验菌液混匀，33 ℃培养24 h。取0.1 mL 接种至10 mL RV 沙门菌增菌液体培养基中，33 ℃培养24 h，划线接种到木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，33 ℃培养24 h。挑取疑似菌落用沙门菌生化鉴定条鉴定。菌液对照组：取1 mL 小于100 cfu 的沙门菌试验菌液加入90 mL 胰酪大豆胨液体培养基中，33 ℃培养24 h。取0.1 mL接种至10 mL RV 沙门菌增菌液体培养基中，33 ℃培养24 h，划线接种到木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，33 ℃培养24 h。挑取疑似菌落用沙门菌生化鉴定条鉴定。空白对照组：90 mL 胰酪大豆胨液体培养基中，33 ℃培养24 h。取0.1 mL 接种至10 mL RV 沙门菌增菌液体培养基中，33 ℃培养24 h，划线接种到木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，33 ℃培养24 h。结果见表3，4。

表3 金银花控制菌方法试验结果

表4 菊花控制菌方法试验结果

2.5 供试品微生物限度检查

取供试品溶液10 mL 置水浴煮沸30 min 后置冷水中迅速冷却，测定耐热菌总数。

供试品微生物限度检查结果见表5，6。

表5 金银花检验结果

表6 菊花检验结果

《中国药典》2020 年版规定直接口服及泡服饮片的需氧菌总数可接受的最大菌数为105cfu/g，霉菌和酵母菌总数可接受的最大菌数为103cfu/g，耐胆盐革兰阴性菌可接受的最大菌数应小于104cfu/g，不得检出大肠埃希菌（1 g），不得检出沙门菌（10 g）。样品检验均符合规定。

3 讨论

微生物限度检查是药品安全的重要指标，是客观衡量药品质量的重要指标［8-9］。《欧洲药典》《美国药典》《日本药局方》均将植物药或天然药微生物限度作为安全性控制项目。《中国药典》2020 年版中药标准的重点是加强安全性控制，微生物污染物控制对加强中药安全性有重要意义，规定中药饮片微生物限度检查法，让中药饮片的微生物限度检查有了依据，为控制中药饮片微生物污染，加强中药安全性控制奠定了基础，为提高中药饮片质量标准和促进中药国际化提供了更全面的参考。

金银花含有包括挥发油类、有机酸类、黄酮类、三萜皂苷类和环烯醚萜类等成分［10-11］。研究证实其具有多种生物活性，如抗菌、抗炎、解热、抗病毒等［12］。金银花常作为清热解毒的良药，具有很好的抗炎活性［13-16］。菊花含有黄酮类、多糖类、酚类物质［17-20］。研究表明，菊花中含有多种抑菌成分，具有抑菌作用，菊花还有中草药中“广谱抗生素”的称号［21］。实验表明，20 min 振摇荡洗金银花中抑菌成分溶解量达不到抑菌浓度；在控制菌检查中对阳性菌也未见影响。

4 结论

中药饮片金银花、菊花需氧菌总数，霉菌和酵母菌总数，控制菌检查均可用常规法进行微生物限度检查，方法简便、准确、安全、可靠。