miR-204、CXCL8与心肌梗死继发室性心律失常的关系

冯 冰，强建康，罗建强

心肌梗死是因冠状动脉粥样硬化形成血栓，导致冠状动脉分支回流中断造成心肌持续缺血、心肌功能暂停的症状，心肌梗死常伴有心室颤动、心力衰竭、心动过速及心律失常等并发症[1]。室性心律失常是一种较严重的心律失常，容易影响病人的生活质量甚至造成死亡[2]。微小RNA-204(miR-204)与心肌缺血再灌注损伤密切相关[3]。CXC趋化因子配体8(CXCL8)作为一种炎性趋化因子，在心肌缺血再灌注损伤、心力衰竭中发挥关键作用[4]，且在大肠癌中，miR-204与CXCL8存在靶向关系[5]。然而，目前关于心肌梗死中miR-204与CXCL8之间的关系以及二者对心肌梗死病人继发室性心律失常影响的研究较少。本研究通过探讨血清miR-204、CXCL8水平与心肌梗死病人继发室性心律失常的关系，以期为此类病人不良预后的早期预测提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2019年1月—2020年1月于陕西省第二人民医院住院治疗的心肌梗死病人152例作为研究对象，根据急性期有无继发室性心律失常分为未继发室性心律失常组(98例)和继发室性心律失常组(54例)。本研究经医院伦理委员会批准，所有病人及家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：①心肌梗死诊断符合《急性ST段抬高型心肌梗死诊断和治疗指南(2019)》[6]中的诊断标准，并伴有心肌坏死标志物的改变；②室性心律失常诊断符合《2020室性心律失常中国专家共识(2016共识升级版)》[7]中诊断标准；③病例资料完整者。排除标准：①伴有各种风湿性心脏病、先天性心脏病、心脏瓣膜病、心肌病者；②曾有介入手术史，发生再梗死者；③伴有高血压或脏器功能障碍者；④伴有血液病、免疫系统、感染性疾病或恶性肿瘤者。

1.3 试剂与仪器 RNA提取试剂盒(货号：R1200-100)购自北京索莱宝科技有限公司；反转录试剂盒(货号：RP1105)购自上海恒斐生物科技有限公司；miScript SYBR Green Mix(货号：218073)购自德国QIAGEN公司；CXCL8 酶联免疫吸附测定法(ELISA)试剂盒(货号：abs510004)购自爱必信(上海)生物科技有限公司；MMP-3 ELISA试剂盒(货号：KA0394-E)、基质金属蛋白酶(MMP)-9 ELISA试剂盒(货号：KA0398-E)、基质金属蛋白酶抑制因子(TIMP)-1 ELISA试剂盒(货号：70-EK1138-24)均购自杭州联科生物技术股份有限公司。实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)仪(型号：CFX384)购自美国Bio-Rad公司；全自动生化分析仪(型号：Selectra E)购自上海玉研科学仪器有限公司；酶标仪(型号：Tecan Infinite F50)购自上海桑晒生物科技有限公司。

1.4 研究方法

1.4.1 样品采集及保存 采集病人入院第2天晨起空腹肘静脉血样，3 000 r/min离心15 min后收集血清，置于-80 ℃保存待测。

1.4.2 一般资料收集 查阅门诊及住院病历，收集整理病人入院时的一般资料，包括性别、年龄、吸烟史、高血压、高脂血症、冠心病、糖尿病、病变血管支数。采用全自动生化分析仪检测三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、肌酐水平，操作步骤严格按照仪器说明书进行。

1.4.3 血清miR-204水平测定 采用RNA提取试剂盒提取血清总RNA，反转录试剂盒将RNA反转录得到cDNA，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。采用qRT-PCR仪对miR-204及其内参U6进行扩增，引物序列见表1(引物由上海生工生物工程股份有限公司设计并合成)。反应体系共20 μL：cDNA模板(50 ng/μL)2 μL、miScript SYBR Green Mix 10 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL、ddH2O 6.4 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，40个循环。每份样品均设3个重复孔，采用2-△△CT法计算血清miR-204相对表达量。

表1 qRT-PCR引物序列(5′-3′)

1.4.4 血清CXCL8、MMP-3、MMP-9、TIMP-1水平测定 采用ELISA法检测血清CXCL8、MMP-3、MMP-9、TIMP-1水平，操作步骤严格按照仪器及试剂盒说明书进行。

2 结 果

2.1 两组一般资料比较 两组性别、年龄、吸烟史、高血压、高脂血症、冠心病、糖尿病、肌酐、TC、LDL-C、病变血管支数比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；继发室性心律失常组TG水平高于未继发室性心律失常组，HDL-C水平低于未继发室性心律失常组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 两组一般资料比较

2.2 两组血清miR-204、CXCL8、MMP-3、MMP-9、TIMP-1水平比较 继发室性心律失常组CXCL8、MMP-3、MMP-9、TIMP-1水平高于未继发室性心律失常组，miR-204水平低于未继发室性心律失常组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 两组血清miR-204、CXCL8、MMP-3、MMP-9、TIMP-1水平比较(±s)

2.3 心肌梗死后继发室性心律失常病人miR-204、CXCL8与MMP-3、MMP-9、TIMP-1、TG、HDL-C水平的相关性 Pearson相关性分析结果显示，心肌梗死后继发室性心律失常病人miR-204与CXCL8呈负相关(P<0.05)，详见图1。miR-204与HDL-C水平呈正相关(P<0.05)，与MMP-3、MMP-9、TIMP-1、TG水平呈负相关(P<0.05)；CXCL8与MMP-3、MMP-9、TIMP-1、TG水平呈正相关，与HDL-C水平呈负相关(P<0.05)。详见表4。

图1 心肌梗死后继发室性心律失常病人miR-204与CXCL8水平的相关性

表4 心肌梗死后继发室性心律失常病人miR-204、CXCL8与MMP-3、MMP-9、TIMP-1、TG、HDL-C水平的相关性

2.4 血清miR-204、CXCL8水平对心肌梗死病人继发室性心律失常的预测价值 以血清miR-204、CXCL8水平为检验变量绘制ROC曲线，结果显示，血清miR-204、CXCL8水平预测心肌梗死病人继发室性心律失常的曲线下面积(AUC)分别为0.863[95%CI(0.804，0.922)]、0.848[95%CI(0.783，0.913)]，截断值分别为0.881、22.751 pg/mL，特异性分别为67.3%、78.6%，敏感度分别为90.7%、79.6%；二者联合预测的AUC为0.908[95%CI(0.855，0.961)]，特异性为85.7%，敏感度为83.3%。详见图2。

图2 血清miR-204、CXCL8水平预测心肌梗死病人继发室性心律失常的ROC曲线

2.5 影响心肌梗死病人继发室性心律失常的多因素Logistic回归分析 将心肌梗死病人是否继发室性心律失常作为因变量，以miR-204、CXCL8、MMP-3、MMP-9、TIMP-1、TG、HDL-C作为自变量进行Logistic回归分析，结果显示miR-204是心肌梗死病人继发室性心律失常的保护因素(P<0.05)，CXCL8是心肌梗死病人继发室性心律失常的独立危险因素(P<0.05)。详见表5。

表5 影响心肌梗死病人继发室性心律失常的多因素Logistic回归分析结果

3 讨 论

室性心律失常是导致心肌梗死病人早期死亡的原因之一[8]。室性心律失常的临床症状主要有心室颤动或持续性室性心动过速，严重威胁病人的生命安全[9]。目前，关于心律失常的研究已十分广泛和深入，但临床中仍缺乏较为理想的心肌梗死后继发室性心律失常的预警指标，且无法评估发生心脏猝死的危险性[10]。因此，寻找可靠指标准确评估心肌梗死病人发生室性心律失常的风险，及时采取干预措施，对于病人的治疗和预后恢复意义重大。

miRNA参与调节肿瘤发生，细胞增殖分化、凋亡等多种病理、生理过程，且在心力衰竭及心肌重构中发挥重要作用[11]。miR-204对心肌细胞的自噬有抑制作用，且可能通过抑制自噬降低心肌缺血再灌注损伤的影响[12]。本研究结果显示，与未继发室性心律失常的心肌梗死病人相比，继发室性心律失常病人血清miR-204呈低表达，与Qiu等[13]研究中miR-204的表达趋势一致，提示miR-204低表达可能与继发室性心律失常密切相关，其作用机制可能与miR-204水平降低后心肌缺血再灌注损伤加重有关。CXCL8受体为CXC趋化因子受体2，其主要生物学活性是激活或吸引中性粒细胞，而中性粒细胞可黏附于缺血心肌细胞，进而影响心律失常的发生、发展[14]。此外，CXCL8可影响MMP的分泌[4]。本研究结果显示，心肌梗死继发室性心律失常病人血清CXCL8高于未继发室性心律失常病人，与崔莹莹等[15]研究结果中CXCL8的表达趋势一致；且CXCL8与miR-204呈负相关。推测病理状态下miR-204表达水平降低后靶向调控CXCL8，使其表达水平升高，而CXCL8可能通过调控其下游炎性因子和中性粒细胞水平，影响室性心律失常的发生。研究表明，MMP-3、MMP-9、TIMP-1均是与急性心肌梗死、血管重构、心室重构密切相关的指标[16-17]；TG、HDL-C等血脂指标水平对心律失常等心血管疾病有重要的提示作用[18]。而本研究中CXCL8、miR-204均与MMP-3、MMP-9、TIMP-1、TG、HDL-C呈一定的相关性。推测miR-204靶向调控CXCL8表达后，CXCL8可能通过调控炎症反应，增加MMP-3、MMP-9、TIMP-1表达和分泌水平，进而影响心肌纤维化等过程，介导室性心律失常的发生；或者CXCL8通过调控心肌梗死病人体内血脂水平，增加室性心律失常发生概率。CXCL8、miR-204均是心肌梗死病人继发室性心律失常的影响因素，且二者对心肌梗死病人继发室性心律失常有一定的预测价值，其中miR-204的预测敏感度高于CXCL8，CXCL8的预测特异性高于miR-204，二者联合后的预测特异性明显提高，临床中可将二者联合用作预测室性心律失常发生的参考指标。

综上所述，心肌梗死后继发室性心律失常病人血清CXCL8明显升高，miR-204明显降低，二者均是心肌梗死病人继发室性心律失常的影响因素，且可能会成为预测室性心律失常发生的潜在指标。临床通过检测miR-204、CXCL8水平变化，及时制定有效、合理的针对性治疗措施，以降低室性心律失常发生率，改善预后。但miR-204、CXCL8的实际临床应用价值仍需进一步探索，且二者的作用通路需后续通过细胞或动物试验进一步验证。