基于Ag2S/BiOBr的传感器检测人体血清中刀豆球蛋白A的研究

陈代武，彭若君，李核

(1.邵阳学院 国际学院，湖南 邵阳，422000；2.华南师范大学 化学学院，广东 广州，510006)

刀豆球蛋白 A(ConA)是一种植物血凝素，具有很强的促有丝分裂和促进淋巴细胞转化的作用，它还可以选择性地激活抑制性 T(TS)细胞[1]，在细菌和病毒感染和癌细胞转移等调节免疫反应中发挥重要的作用[2-3]。目前检测ConA的方法主要有荧光法[4]、表面等离子体共振[5]、电化学生物传感器[6]等。然而，这些方法存在灵敏度低、操作复杂等缺点[6]。因此，建立灵敏度高、选择性好的ConA检测方法在生物医学领域是十分必要的，而溴氧化铋(BiOBr)和硫化银(Ag2S)复合材料制成的光电化学传感器具有灵敏度高和选择性好等特点，本研究将此光电化学传感器用于检测人体血清中ConA具有重要意义，同时也为生物医学领域检测人体血清中其他高分子提供科学方法和参考依据。

1 实验部分

1.1 主要仪器和试剂

PH计(PHSJ-3F，上海科学仪器有限公司)，超声波清洗机(AS3120b，天津奥特赛恩斯仪器有限公司)，干燥箱(DGG-9053A，上海森信实验室仪器有限公司)，迷你涡旋混合器(生工生物科技(上海)有限公司)、Autolab电化学工作站(PGSTAT302N，瑞士万通中国有限公司)和 SEM(蔡司 Ultra55，卡尔蔡司光学(中国)有限公司)。氯金酸、磷酸二氢钠、盐酸、三(羟甲基)氨基甲烷、硫化钠、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、硝酸铋、硝酸银和巯基丙酸(MPA)购自阿拉丁试剂(上海)有限公司，所有试剂均为分析纯。

1.2 ITO-PET预处理

将柔性氧化铟锡/聚对苯二甲酸乙二醇酯(ITO-PET)片材(210 mm×290 mm)切成25 mm×10 mm的薄片，用带圆孔(直径0.5 cm)的绝缘透明胶密封ITO-PET切片，再分别用酒精和去离子水清洗，保存用作基地电极。

1.3 BiOBr的合成

在文献[7]的基础上进行适当修改合成。称取0.952 6 g Bi(NO)3·H2O放入100 mL烧杯中，加 35 mL 乙二醇溶解。将 1.450 8 g CTAB 添加到烧杯中，搅拌溶解并转移到反应器中，将反应器置于真空烘箱中。烘箱温度从室温升至400 ℃并保持4 h，然后冷却至室温，得到灰白色BiOBr。取适量BiOBr，用少量去离子水溶解于25 mL烧杯中，然后取一定量溶液至2 mL容量瓶中，得到一定浓度的BiOBr溶液(4、6、8、10和12 mg·mL-1)，用于后续实验。

1.4 Ag2S/BiOBr/ITO-PET电极的制备

按文献[8]进行改进制备电极。将 20 μL BiOBr(8 mg·mL-1)水性悬浮液滴在干净的 ITO-PET 电极切片的圆形区域上并自然干燥。然后，在BiOBr/ITO-PET电极中加入20 μL 0.1 mol·L-1巯基丙酸溶液，用红外光照射10 min，得到3-MPA修饰的BiOBr/ITO-PET电极。在 3-MPA 修饰的BiOBr/ITO-PET 电极上加入 20 μL 0.08 mol·L-1AgNO3溶液，置于黑暗环境中 30 min。最后，在电极中加入 20 μL 0.1 mol·L-1Na2S 溶液，在黑暗环境中放置 30 min，得到 Ag2S/BiOBr/ITO-PET 电极。

1.5 金纳米胶体的制备

通过氯金酸的柠檬酸钠还原制备金纳米胶体[9]。将1 mL 1%氯金酸溶液加入100 mL容量瓶中，用去离子水稀释至100 mL，得到0.01%氯金酸溶液；然后，取0.5 g柠檬酸钠溶解并用去离子水稀释至50 mL，得到10 mg·mL-1柠檬酸钠溶液。将配制好的0.01%氯金酸100 mL转移到200 mL圆底烧瓶中，加热煮沸15 min，然后，快速加入配制好的10 mg·mL-1柠檬酸钠，继续加热煮沸10 min，停止加热，自然冷却至室温，得到金纳米胶体。

1.6 光电化学传感器的构建

通过在 Ag2S/BiOBr/PET-ITO 电极中加入10 μL金胶体溶液制备工作电极，使用前保存于4 ℃冰箱。光电化学系统由Ag/AgCl 电极作为参比电极，铂电极作为对电极，Ag2S/BiOBr/PET-ITO 电极为工作电极。

2 结果与讨论

2.1 光电传感器构建原理

光电化学传感器的构建过程见图1。在该系统中，BiOBr作为光电敏感材料吸收光并将其转换为电信号。金胶体主要用作信号放大器和电子导体。Ag2S 纳米粒子与BiOBr结合形成纳米复合层，进一步增强了光吸收和光电转换效率[8]。纳米复合层还提供了与蛋白质特异性结合的平台。Ag2S/BiOBr复合材料在可见光照射下产生的光电子将传输到 ITO-PET 电极以产生光电流。然而，当目标ConA在电极上孵育时，它会抑制电子传输，导致信号降低。因而可以根据电流的变化来进行ConA定量检测。

图1 光电传感器构建示意图

2.2 电极材料的 SEM 表征

图2为BiOBr和Ag2S/BiOBr扫描电子显微镜(SEM)图，图 2(a)表明，BiOBr具有层状微球形态，层状微球由许多纳米片和纳米颗粒组成[10]，为 Ag2S 的原位生长提供了大的表面积。图2(b)表明，Ag2S 纳米粒子在 MPA 修饰的BiOBr的分级表面上原位生长。所有结果证明Ag2S/BiOBr复合材料层已成功制备。

(a)BiOBr;(b)Ag2S/BiOBr

2.3 电极的电化学表征

通过光电流响应和电化学阻抗谱的方法表征电极的修饰过程，见图3。图3(a)显示了不同修饰电极的光电流-时间(I-t)曲线。由图3(a)可知，曲线a为裸ITO-PET电极的光电流响应，曲线b为BiOBr修饰后的光电流信号。这些结果表明，BiOBr可以提高光电转换效率。当在上述电极上修饰Ag2S 时，光电流进一步增强(图3(a)中的曲线 c)。这是由于Ag2S是一种窄带半导体材料，在光照下具有良好的光捕获和光电转换能力。然而，在上述电极上连续修饰金胶体(曲线d)和ConA(曲线e)后，光电流逐渐减小，可能的原因是半导体纳米粒子和金纳米粒子之间存在共振能量转移[11]，ConA阻碍了电极和溶液之间的电子转移，导致光生空穴更倾向于与光生电子复合，因此观察到光电流信号下降。层状改性ITO-PET电极在含0.1 mol·L-1[Fe(CN)6]3-0.1 mol·L-1KCl的溶液中进行电化学阻抗谱(EIS),见图3(b)。EIS结果进一步验证了I-t曲线的可靠性，见图3(a)。EIS图由两部分组成：一是与高频区电荷转移过程对应的半圆形部分；另一个是对应于低频区扩散过程的线性部分。电荷转移电阻(Rct)值随着在 ITO-PET 电极上改性的不同材料而变化。从图3(b)可以看出，ITO-PET 的Rct值在这些修饰电极中最低(曲线 b、c、d、e)。Rct值随着BiOBr、Ag2S、Au胶体修饰和ConA键合的ITO-PET的变化而变化。这表明修饰电极制备成功。

(a)光电流响应；(b)交流阻抗图

2.4 实验条件的优化

为了获得优异的光电化学传感器性能，提高它的灵敏度和选择性，详细探究了BiOBr浓度、激发波长、偏压和溶液pH等实验条件对传感器性能的影响。

2.4.1 BiOBr浓度的影响

为了考察BiOBr浓度对光电流的影响，不同浓度BiOBr溶液(4、6、8、10和12 mg·mL-1)被修饰在电极上研究光电流的变化，结果见图4(a)。结果表明，当BiOBr溶液浓度为8 mg·mL-1时，光电流最大。如果浓度过高，修饰层的厚度会进一步增加。这将不利于光电子传输，从而导致光电流降低[7]。如果浓度太低，由于电极上修饰的BiOBr量太少，无法获得最大光电流。因此，选择8 mg·mL-1的 20 μL BiOBr溶液进行后续的实验。

2.4.2 激发波长和偏压

图4(b)显示了365、375、395、420、450、475、490、520 和590 nm的激发波长分别对光电流的影响。结果表明，在475 nm的激发波长下获得了最大光电流，这意味着能量与Ag2S/BiOBr复合材料的能量更匹配，而且无光照时，所有电极的光电流信号几乎与基地电极的光电流一致。因此，选择 475 nm 作为激发波长进行后续实验。还研究了偏位以获得出色的光电流信号，结果见图4(c)。当偏压施加到0时，在这些试验偏压中获得了最强的光电流信号。所以，后续实验采用0作为偏压。

(a)BiOBr的浓度;(b)激发波长;(c)偏压;(d)缓冲溶液pH

2.4.3 缓冲液pH的优化

为了研究pH对所得光电化学传感器和ConA稳定性的影响，使用不同pH(pH=7.0、7.5、8.0、8.5和9.0)的Tris-HCl缓冲溶液进行测试。如图4(d)所示，当Tris-HCl缓冲溶液的pH值为8.5时，该传感器的光电流响应达到最大值。在随后的实验中使用pH值为8.5的Tris-HCl溶液作为缓冲液。

2.5 ConA检测的光电化学性能

不同浓度的ConA由所提出的PEC传感器在最佳实验条件下确定。如图5(a)所示，随着ConA浓度的增加，光电流逐渐减小。此外，光电流是ConA在0.001 ng·mL-1～100 ng·mL-1范围内浓度的对数，呈线性关系，线性方程为：I=-0.162 2 lgCConA+ 0.912 81，相关系数的平方根为 0.993 0。其中，I是光电流(μA)；CConA是ConA的浓度(ng·mL-1)。检测限为0.35 pg·mL-1(S/N=3)。

(a)光电流随ConA浓度的变化；(b)选择性

研究了PEC传感器检测ConA的选择性，以验证其实用性。通过100 ng·mL-1BSA、100 ng·mL-1葡萄糖、1 ng·mL-1ConA和 100 ng·mL-1BSA、1 ng·mL-1的混合物测试光电流响应分别为ConA和 100 ng·mL-1葡萄糖。结果表明，当这些干扰物质存在时，对ConA的测定没有明显影响,见图5(b)。这表明新型 PEC 传感器具有优异的选择性。

2.6 血清样品中ConA的检测

通过对血清样品中加入不同浓度ConA进行回收率的研究，见表1。人体血清中ConA的平均回收率范围为99.7%～106.7%，RSD范围为1.25%～3.72%。并且将该方法与其他方法进行了比较(表2)。结果表明,该PEC传感器具有较好的灵敏度和选择性，在实际血液样本分析中具有潜在的实用价值。

表1 人体血清中ConA测定

表2 ConA不同测定方法比较

3 结论

Ag2S/BiOBr是通过原位生长合成的，并成功地用于制造 PEC 生物传感器来检测ConA。微球BiOBr为负载更多的Ag2S提供了一个平台来放大检测信号，Ag2S不仅可以作为光吸收剂，还可以作为光电流放大器。它们在信号放大和提高 PEC 生物传感器灵敏度方面发挥作用。所提出的 PEC 生物传感器可以在1.0×10-3～1.0×102ng·mL-1的范围内测定ConA，检测下限为 0.35 pg·mL-1。人体血清分析结果表明，所提出的PEC生物传感器在生物分析方面灵敏度高，选择性好，具有潜在的应用价值。