去甲肾上腺素对卵巢癌基因表达谱的影响

黄华龙，宫喜双，穆艳超，朱慧，谢巧婷

(安阳市妇幼保健院 a.妇科；b.检验科；c.病理科，河南 安阳 455000)

卵巢癌具有早期症状隐匿、易转移和化疗后易耐药的特点，在妇科恶性肿瘤中，其病死率居首位[1]，确诊时约75%的患者已属晚期[2]。现有的治疗方案不断发展，但均未达到完全治愈，晚期卵巢癌患者的5 a生存率为20%～30%[3]，对女性的身体健康和生命安全构成严重威胁。以往流行病学调查和临床研究表明，焦虑、抑郁、社会隔离等心理因素和生活习惯与卵巢癌的发生和发展密切相关[4]。该病尚缺乏有效的筛查手段，因此研发灵敏度和特异性高的早期诊断标志物，有利于有效抑制卵巢癌进展，对于降低卵巢癌患者病死率和提高5 a生存率具有重要意义。研究发现，交感神经递质去甲肾上腺素(noradrenaline，NA)对于肿瘤具有调节作用。NA可调节机体免疫系统功能，如通过抑制T细胞对有丝分裂原刺激的反应、削弱自然杀伤细胞的细胞毒活性等促进恶性肿瘤的进展[5]。另外，NA可直接作用于肿瘤细胞，上调促血管生成分子表达，加快肿瘤组织生长和血管形成[6]，因此NA对卵巢癌的影响受到了广泛关注。本研究通过生物信息学分析筛选候选基因，并验证FOSB、JUNB、CD4、HLA-DRA基因在NA水平高的卵巢癌组织中表达异常。

1 材料与方法

1.1 临床资料选取安阳市妇幼保健院妇科2020年7月至2021年6月50例卵巢患者肿瘤组织作为研究对象。纳入标准：(1)病理检查确诊为上皮来源的Ⅰ～Ⅱ期卵巢浆液性癌；(2)无其他主诉症状，辅助检查无其他器官异常病变；(3)患者年龄为52～66岁。将术后组织NA≤1.00 ng·L-1的患者纳入对照组，≥1.00 ng·L-1的患者纳入试验组。对照组25例，年龄52～66(60.0±4.4)岁；试验组25例，年龄52～66(57.8±5.1)岁。两组间临床资料差异无统计学意义(P>0.05)。本研究报请安阳市妇幼保健院医学伦理委员会审议获得批准，患者均已知情并签署知情同意书。

1.2 高通量测序数据处理从National Center for Biotechnology Information(NCBI)(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)Gene Expression Omnibus(GEO)数据库在线获取高通量测序原始数据，系列号为GSE103737。GSE103737数据集共97例卵巢癌患者，NA≤1.00 ng·L-1的患者为对照组，≥1.00 ng·L-1的患者为试验组，取卵巢癌组织，抽提总RNA，按照Illumina作业指导书对RNA依次进行片段化、修复端部、连接和建库，使用Illumina HumanHT-12 V4.0 expression beadchip对文库测序。

1.3 筛选差异表达基因(differentially expressed genes，DEG)筛选条件：|log2(fold change)|>1，且-log10P>-log100.05。其中，log2(fold change)>1即高表达，log2(fold change)<-1即低表达。

1.4 基因富集分析使用在线工具DAVID对差异表达基因富集情况和信号通路Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)进行分析。使用DAVID在线工具计算各富集组的P值，P<0.05为差异有统计学意义。

1.5 STRING数据库分析进入STRING在线数据库主页(https://cn.string-db.org)，点击搜索，选择多蛋白分析模式，将DEG列表导入在线搜索框，物种选择为“Homo sapiens”，点击提交进行识别和在线分析，下载分析后的蛋白间的相互关系(protein- protein interaction，PPI)数据表格，置信度大于0.99筛选为候选基因。

1.6 组织NA水平检测在冰盘上取肿瘤组织，加入预冰冷的1 mol·L-1的高氯酸溶液(20 mL·g-1组织)和2 g·L-1的3，4-二羟基苄胺(3,4-dihydroxybenzylamine，DHBA)(25 mL·g-1组织)，在研钵中加入液氮研磨，4 ℃条件下12 000 r·min-1离心20 min，取上清用于分析。上清液pH值调制为6.0，加入0.2 g酚醛离子交换树脂，震荡10 min，吸出上清。在树脂中加入1 mL蒸馏水洗涤，弃上清。取0.5 mol·L-1的HCl于试管中，混合10 min，洗提出组氨酸(Histamin，Hist)和NA，离心后取40 μL上清用于衍生反应，取20 μL进行色谱测定。

1.7 实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)取新鲜组织，在核酸提取仪上研磨组织，提取总RNA。使用NanoDrop 2000分光光度仪检测RNA浓度，OD260/OD280>1.90表示RNA纯度良好，用于试验。Roche Titan One Tube RT-PCR试剂盒用于逆转录。逆转录体系为：1 μL Random Primer，3.5 μg RNA，加无酶水至25 μL。逆转录产物保存于-80 ℃冰箱。qPCR实验在Roche combas z480仪器上进行，扩增引物选购于上海生工公司。扩增反应体系为25 μL，每个基因3个平行孔，ACTB为内参基因，扩增程序：95 ℃ 10 min，(95 ℃ 15 s，64 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，40个循环)，37 ℃ 1 min。扩增数据分析使用2-ΔΔCt法。引物序列见表1。

表1 本研究所用引物序列信息

2 结果

2.1 高通量测序数据中不同组织的DEG原始数据首先归一化处理，共计110个DEG满足筛选条件[|log2(fold change)|>1，且-log10P>-log100.05]，其中高表达12个，低表达98个。见图1。

图1 符合筛选条件的DEG P值的负对数与倍数对数分布图

2.2 DEG功能分布情况DAVID在线工具分析显示DEG富集最多的10个信号通路为信号转导通路、炎症反应通路、免疫反应通路、凋亡通路、细胞内信号转导通路、基因表达正调控通路、凋亡正调控通路、基因表达负调控通路、T细胞受体信号通路和胞外基质组织通路。见表2。

表2 GSE103737中DEG富集的信号通路情况

2.3 候选基因的筛选情况使用STRING在线数据库分析DEG。在PPI关系网中，39个基因编码蛋白PPI置信度大于0.99。见表3。符合筛选条件的39个基因列为候选基因，进一步验证。

表3 GSE103737中DEG编码蛋白PPI分析

2.4 候选基因验证结果在50例Ⅰ～Ⅱ期浆液性卵巢癌组织中验证39个候选基因，其中FOSB、JUNB、CD4、HLA-DRA表达量差异具有统计学意义(P<0.05)，其余35个基因表达量差异无统计学意义(P>0.05)。试验组FOSBmRNA相对表达量高于对照组(P<0.05)，JUNBmRNA、CD4mRNA、HLA-DRAmRNA相对表达量低于对照组(P<0.05)。见表4。验证基因表达散点图见图2。

表4 qPCR验证候选基因mRNA表达情况

图2 验证基因表达情况

3 讨论

近年来我国卵巢癌发病率与病死率总体呈现下降趋势，但存在地区差异。城市女性卵巢癌发病率与病死率处于下降与平稳状态，农村有逐年上升趋势。卵巢癌的进展机制尚未完全明确。以往研究表明，心理因素和生活习惯均与卵巢癌的发生和发展密切相关[7]。探索卵巢癌发生发展过程中的生物标志物有助于实施精准治疗措施、及时明确其诊断、科学评价患者预后，对于保障患者的生命安全和提升患者的生活质量具有重要意义。

本研究从生物信息学分析出发，在97例Ⅰ～Ⅳ期卵巢癌患者组织高通量测序数据中，发现110个基因满足建立的筛选条件，在卵巢癌进展过程中，表达发生变化的基因存在一定的内在联系，共同协作完成肿瘤恶性行为的进展，或相互拮抗实现机体的自我保护功能。筛选DEG利于从卵巢癌基因调控出发，开启后续研究。本研究利用DAVID数据库分析差异表达及基因内在联系，数据显示DEG富集最多信号通路涉及信号转导、炎症反应、免疫反应、凋亡、胞外基质组织信号传递等。这些重要的生理功能在细胞生命周期中发挥着重要作用，信号通路发生失衡将影响正常的细胞周期活动。炎症反应、免疫反应、凋亡等信号的失调对于卵巢癌的治疗具有显著影响，许多患者在一线治疗完全缓解后出现复发，且在后续化疗周期中，患者复发时间间隔逐步缩短、化疗药物剂量限制性毒性显著增加，最终导致患者对药物敏感性降低，这也是卵巢癌患者治疗失败及死亡的主要原因[8]。

多种生物标志物被验证在卵巢癌进展中具有显著作用，慢性应激与肿瘤发生、发展密切相关，交感神经递质NA在卵巢癌中具有促进肿瘤细胞生长和加快肿瘤血管形成的作用，干预NA途径的特定靶基因有助于控制卵巢癌的进展[9]。本文发现NA≥1.00 ng·L-1的试验组卵巢癌组织中FOSB基因相对表达量高于NA≤1.00 ng·L-1的对照组卵巢癌组织，JUNB、CD4、HLA-DRA基因相对表达量低于对照组。以往研究发现，FOSB基因在卵巢癌中呈现高表达，NA可正向调控FOSB基因表达，NA高表达的患者肿瘤组织中FOSB基因表达进一步提高，其表达产物可驱动卵巢癌的增殖与转移[10]，在体外实验中使用siRNA下调FOSB基因表达可降低卵巢癌的增殖与转移行为。JUN家族成员有多个蛋白，在卵巢癌组织中可调控细胞增殖和血管生成[11]。本研究发现JUN家族成员JUNB在NA≥1.00 ng·L-1的试验组中表达减少，这对于卵巢癌患者是一项有利的指标。CD4与HLA-DRA通过调节免疫系统参与肿瘤的进展。CD4/CD8比值降低和CD8水平增高是免疫球蛋白G无应答者个体化多肽接种后良好的预后指标，本研究发现在NA≥1.00 ng·L-1的试验组中CD4表达减少，这将有助于降低CD4/CD8比值，有助于卵巢癌的治疗。HLA-DRA在卵巢癌中被证实高表达，促进卵巢癌的恶性行为，本研究发现在NA≥1.00 ng·L-1的试验组中HLA-DRA表达减少，这将不利于卵巢癌细胞的恶行进展。本研究提示，NA水平高的卵巢癌患者中，DEG对于肿瘤的恶性进展调控作用并不一致，这将提示人们需要综合调节卵巢癌中不同指标，有效利用有利指标并且合理抑制不利指标，达到精准治疗目标。

基因相关研究有望为探明卵巢癌发生发展机制提供依据。本研究未建立动物模型且样本量较小，更大样本量与动物模型的建立将有助于深入研究基因表达差异、基因转录调控的机制。