石榴叶浸提液对6种常见牧草种子萌发及幼苗生长的化感作用

张曼， 单春燕， 陈志远， 王柳洁， 张少龙， 侯贺平， 李玉英， 张龙冲,

(1.河南农业大学林学院，河南 郑州 450002； 2.河南省软籽石榴工程研究中心，河南 南阳 473000)

植物化感作用是一种植物通过向环境释放化学物质而对其他植物(包括微生物)所产生的直接或间接的有利或不利影响，在自然界中普遍存在，对群落内种间关系起着重要作用[1]。植物的种子萌发及幼苗生长阶段在其生活史中至关重要，亦是较为脆弱阶段。植物间化感作用会直接影响受体幼株对土壤养分、光照、水分等环境因子的竞争，进而影响其在群落中的地位和作用[2-4]。在黄土丘陵区退耕地植被演替中，茵陈蒿(Artemisiacapi-llaris)浸提液对群落中其他植物的种子萌发和幼苗生长产生了明显的化感抑制作用，从而成为前期先锋种群[5]。RICE等[1]认为，植物的化感作用同样对先锋种群的消失起着重要的作用，先锋种群产生的化感物质在直接抑制其他植物生长的同时，亦可抑制其固氮微生物的生长，使根周围土壤缺氮，进而影响该植株自身正常的生长。

生草是较为先进的果园管理模式，指通过在果树行间或全园种植草本植物，对果园土壤、小气候、病虫害、树体生长及果实品质等方面产生积极影响[6]。截至目前，果园生草优势大多从减少果园土壤蒸腾速率，增加土壤肥力、孔隙度和土壤含水量，降低果树冠层空气温度和不同深度的土壤温度，调节果园局部小气候等角度探讨[7-8]。石榴作为一种良好的经济林树种，果实具有丰富的营养价值，花及果皮具有良好的药用价值，在食品、工业、医药、园林绿化等多个领域都有重要用途[9]。单宁类是石榴叶中最普遍的一类化学成分，以水解单宁类为主，主要可分为鞣花单宁类化合物与没食子单宁类化合物，其中鞣花酸在石榴叶中的含量高达0.5%以上[10]。黄舒静等[11]研究表明，短枝木麻黄(CasuarinaequisetifoliaForst.)体内的单宁会对同种幼苗产生化感作用，不仅影响其幼苗的生长，还会影响幼苗体内次生代谢物质的形成，也抑制其过氧化物酶、过氧化氢酶、纤维素酶活性。但目前对石榴的化感作用研究较少，尤其在果园生草模式下石榴是否会对其林下草种生长产生化感作用，更是少有研究。

白三叶、红三叶、狼尾草、鸭茅草、黑麦草、毛苕子均为中国常见的牧草，这些牧草与其他植物之间的化感研究较多。蒋贻朗等[12]研究表明，不同质量浓度的马尾松(PinusmassonianaLamb.)凋落叶水提液对多年生黑麦草表现为抑制作用。沈洁等[13]研究表明，不同质量浓度柽柳(TamarixchinensisLour.)花浸提液对白三叶、黑麦草表现为抑制作用。卢政等[14]研究表明，樟树(Cinnamomumcamphora(L.) Presl)果实水浸液对白三叶发芽率产生低促高抑的双重效应。植物间作方面，已有研究讨论牧草在樱桃(Cerasuspseudocerasus(Lindl.) G. Don)[15]、猕猴桃(ActinidiachinensisPlanch.)[16]、梨(Pyrusspp.)[17]、苹果(MaluspumilaMill.)[18]、花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)[19]等经济树种的果园生草优势。但目前有关石榴与牧草间的化感效应研究，乃至石榴林下的草种选择与林草互作鲜见报道。石榴作为灌木，枝叶繁多且展叶期较长，多数学者认为植物叶片中含有的化感物质较多，故本研究从植物化感的角度，以石榴叶片为供体材料，选择上述6种较常见牧草，通过测定不同质量浓度石榴叶浸提液对6种牧草种子萌发与幼苗生长相关指标的影响，明确石榴叶浸提液对该牧草种子萌发及幼苗生长是否存在化感作用，以期为石榴果园生草的草种选择提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

化感供体材料为石榴无病虫害、成熟近凋谢的叶片。供体材料采自河南省郑州市河南农业大学林木种苗繁育中心荥阳软籽石榴基地，采集时间为2020年11月，石榴品种为河阴石榴。受体材料为白三叶、红三叶、狼尾草、鸭茅草、黑麦草、毛苕子6种，均购于豫科种子公司。

1.2 方法

1.2.1 石榴叶浸提液的制备 将无病虫害的成熟近凋谢石榴叶片用蒸馏水洗去叶片表面灰尘，室温条件下阴干备用。将阴干的石榴叶片研磨成粉末，按1 000∶50(mL∶g)的比例浸泡，置于摇床上120 r·min-1浸提24 h，取上清液用双层滤纸过滤得到质量浓度为 0.05 g·mL-1的母液，放入4 ℃冰箱内储存待用。结合前人研究及预试验情况[20-21]，使用时将石榴叶浸提液母液稀释，最终得3个质量浓度梯度，即0.05、0.025、0.005 g·mL-1。

1.2.2 牧草种子萌发及幼苗生长测定 种子萌发选择大小相近、颗粒饱满的种子，采用培养皿纸培法，每个培养皿50粒。分别量取10 mL的0.05、0.025、0.005 g·mL-1的石榴叶浸提液加入培养皿，并与蒸馏水形成对照，每组设置3个重复，放置于15 ℃条件下培养。每24 h观察并记录6种牧草种子的种子萌发数量 (种子萌发以胚根突破种皮 2 mm为标准)，适时添加相应质量浓度的石榴叶浸提液保持滤纸湿润，连续5 d无萌发时视为发芽结束，选取每个培养皿内种子萌发前期同时段萌发的健康幼苗10株，测量其芽长、根长和鲜质量、干质量等指标。

1.2.3 数据统计

种子发芽率=(规定时间内发芽种子数/供试种子总数)×100 %;

发芽势=(第4天发芽种子数/供试种子总数)×100 %;

发芽指数=∑(Gt/Dt)

式中：Gt为第t天的发芽数,Dt为相应的发芽时间。

根据得出的种子发芽率、发芽势、萌发指数，幼苗的根长和芽长以及幼苗的鲜质量和干质量，并由此计算以上指标在石榴叶浸提液处理下各自的化感效应指数(RI)，参照WILLIAMSO等[22]的计算公式为：

RI=1-C/T(T≥C)，RI=T/C-1(T

式中：C为对照值；T为处理值。当RI>0 时，表示浸提液对受体植物起促进作用；当RI<0 时，表示浸提液对受体植物起抑制作用。RI的绝对值表示化感作用的强度。

综合化感效应(SE)是利用供体植物同一处理下同一受体各测试项目化感效应指数(RI)的算术平均值进行评价[18]。其中，萌发综合化感效应指数=发芽率、萌发指数、发芽势三者化感效应指数的平均值；幼苗综合化感效应指数=芽长、根长、幼苗鲜质量与幼苗干质量四者化感效应指数的平均值；总综合化感效应指数=发芽率、萌发指数、发芽势、芽长、根长、幼苗鲜质量与幼苗干质量七者化感效应指数的平均值。

1.2.4 数据处理 数据均在 SPSS 25.0 软件上进行统计分析，对满足正态分布的数据使用 LSD 法进行多重比较，对少数不满足正态分布的数据使用非参数Kruskal-Wallis法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 石榴叶浸提液对6种牧草种子萌发的影响

表1结果表明，不同质量浓度的石榴叶水浸提液对6种牧草的发芽率表现出不同程度的化感作用，即对黑麦草、狼尾草的种子萌发表现出明显的抑制作用，对鸭茅草、白三叶、红三叶的发芽率表现出“低促高抑”的双重效应，对毛苕子的发芽率表现出促进作用。在供试质量浓度范围内，石榴叶浸提液对狼尾草、毛苕子的发芽率影响均不显著(P>0.05)，但毛苕子发芽率呈现出随浸提液质量浓度加大而增加的趋势。0.05 g·mL-1石榴叶浸提液对黑麦草、鸭茅草、红三叶3种牧草均表现出显著抑制作用(P<0.05)；0.025 g·mL-1处理下，鸭茅草、毛苕子、红三叶发芽率略高于对照组，0.005 g·mL-1处理下，鸭茅草、红三叶发芽率略高于对照组，但其间差异均不显著(P>0.05)。不同质量浓度石榴叶浸提液对白三叶发芽率的影响较为明显，0.005 g·mL-1质量浓度下发芽率提高14%，略微高于对照组，但差异并不显著(P>0.05)，之后随着浸提液质量浓度升高，其受到的抑制作用越强，发芽率显著低于对照组(P<0.05)。

表1 石榴叶浸提液对6种牧草种子萌发指标的影响Table 1 Effects of pomegranate leaf extract on seed germination indexes of six forages

不同质量浓度的石榴叶水浸提液对6种牧草的萌发指数大体表现出不同程度的抑制作用，偶显促进。其中对黑麦草、狼尾草、毛苕子、白三叶表现出完全的抑制作用，随着浸提液质量浓度增大，其抑制作用逐渐增强，且各组间差异较为显著(P<0.05)。鸭茅草、红三叶在0.005 g·mL-1处理下的萌发指数略高于对照组，其中鸭茅草增加了1.1%，与对照组无显著差异(P>0.05)；红三叶提高了20.7%，与其余处理组呈现显著差异(P<0.05)。

不同质量浓度的石榴叶水浸提液对5种牧草的发芽势表现出不同程度的化感作用，延缓了种子萌发速度，而毛苕子发芽势则仍表现为随供试液质量浓度加大而增加趋势，与发芽率所表现出的趋势大体相同。在0.05 g·mL-1时，黑麦草发芽势降低了71.6%，鸭茅草降低88.9%，白三叶降低65.2%，均与其余各处理组呈现出显著差异(P<0.05)，表现出完全的抑制作用。

2.2 石榴叶水浸提液对6种牧草幼苗生长的影响

本研究结果表明(表2)，不同质量浓度的石榴叶水浸提液对6种牧草的幼苗芽长表现出不同程度的化感作用。其中对毛苕子、白三叶表现出抑制作用，且随着浸提液质量浓度增大，其抑制作用逐渐增强。黑麦草、鸭茅草、狼尾草、红三叶在0.005 g·mL-1质量浓度下，幼苗芽长相较于对照组均略有提高，但差异不显著(P>0.05)，而与0.05 g·mL-1质量浓度处理下幼苗芽长差异显著(P<0.05)。黑麦草、白三叶、红三叶、毛苕子在0.025、0.05 g·mL-1处理下，均与对照组呈现显著差异(P<0.05)；鸭茅草在0.05 g·mL-1处理下与对照组差异显著(P<0.05)。

不同质量浓度的石榴叶水浸提液对狼尾、白三叶、红三叶的幼苗根长影响较为明显，表现出“低促高抑”的双重效应。在0.005 g·mL-1质量浓度下，根长生长均高于对照组，分别提高了39.3%、16.4%、12.4%，其间差异显著(P<0.05)，之后随着浸提液质量浓度升高，其受到的抑制作用越强，根长长度显著低于对照组(P<0.05)，且白三叶、红三叶在0.05 g·mL-1处理下根长为0，化感影响极为明显。鸭茅草、黑麦草、毛苕子在不同质量浓度的石榴叶水浸提液处理后，表现出完全的抑制作用，随着浸提液质量浓度增大，其抑制作用逐渐增强。其中鸭茅草、黑麦草在0.05与0.025 g·mL-1质量浓度处理时，与对照组差异较为显著(P<0.05)，毛苕子在3种试验处理下，均与对照组差异显著(P<0.05)。

随着石榴叶水浸提液质量浓度的增大，毛苕子、白三叶的幼苗鲜质量逐渐降低，其中毛苕子各组均与对照组差异显著，白三叶在0.05与0.025 g·mL-1质量浓度处理时，鲜质量降低较为显著(P<0.05)。黑麦草、红三叶在0.005 g·mL-1处理下的幼苗鲜质量略高于对照组，但差异不显著，之后随着石榴叶浸提液质量浓度增加，其抑制作用越强，且与对照组差异显著(P<0.05)。鸭茅草、狼尾草在0.005与0.025 g·mL-1质量浓度处理时，幼苗鲜质量略高于对照组，但差异均不显著(P>0.05)，其中狼尾草在0.005 g·mL-1下幼苗鲜质量提高30.5%，与0.05 g·mL-1处理组差异显著，呈现出“低促高抑”的双重效应。

如表2所示，不同质量浓度的石榴叶水浸提液对毛苕子、白三叶的幼苗干质量表现出完全的抑制作用，随着浸提液质量浓度增加，其所受到的抑制作用逐渐增强。黑麦草、狼尾草在0.005 g·mL-1处理条件下，干质量分别增加11.4%、12.0%，均高于对照组，但两者差异并不显著(P>0.05)，之后随着石榴叶浸提液质量浓度增加，其抑制作用增强。鸭茅草、红三叶在不同石榴叶浸提液质量浓度处理条件下则表现出先降后升的趋势，且红三叶在0.05 g·mL-1处理时，与其余处理组呈现显著差异(P<0.05)。

表2 石榴叶浸提液对6种牧草幼苗生长指标的影响Table 2 Effects of pomegranate leaf extract on growth indexes of six forage seedlings

2.3 石榴叶水浸提液对6种牧草综合化感效应的影响

由本研究中各质量浓度下各草种的化感效应指数可看出(表3)，低质量浓度的石榴叶浸提液(即0.005 g·mL-1)对鸭茅草、红三叶的种子萌发、幼苗生长及总体生长为促进作用，对白三叶种子萌发、狼尾草的幼苗生长及其总体生长为促进作用，随着质量浓度升高，表现为抑制作用，即表现出“低促高抑”的双重效应。而不同质量浓度的石榴叶浸提液对毛苕子、黑麦草的种子萌发和幼苗生长及总体生长均呈现抑制作用，但在低质量浓度时，其抑制作用不明显。不同受体植物对石榴叶片水提液的化感效应响应各异，种子萌发阶段，石榴叶片水提液对其的抑制程度由强到弱为白三叶>黑麦草>狼尾草>鸭茅草>毛苕子>红三叶；幼苗生长阶段，石榴叶片水提液对其的抑制程度由强到弱为:毛苕子>黑麦草>白三叶>红三叶>鸭茅草>狼尾草；总体看来，石榴叶片水提液对其抑制程度由强到弱为毛苕子>白三叶>黑麦草>鸭茅草>红三叶>狼尾草。

表3 石榴叶浸提液对6种牧草化感效应的影响Table 3 Effects of pomegranate leaf extract on allelopathy of six forages

3 结论与讨论

果园生草下植物间化感作用是一种较为普遍的生态现象，尤其牧草较为脆弱时期的生长指标对果树化感作用的反馈，这对林草复合种植的建成至关重要。本研究从种子萌发和幼苗生长角度探讨石榴叶水提液对6种常见牧草的化感作用，结果表明，不同草种对石榴叶浸提液有不同的化感响应。

从本研究中石榴叶水浸提液对6种草种的总综合化感指数来看，浸提液对鸭茅草、狼尾草、红三叶的种子萌发和幼苗生长呈现“低促高抑”双重效应，对黑麦草、毛苕子、白三叶的种子萌发和幼苗生长则呈现了抑制作用。对于不同受体牧草种子所表现的化感响应差异，可能是石榴叶所含化感物质对于受体植物具有一定的选择性作用，或是不同受体植物对化感物质的响应敏感度不同，是植物长期演化过程中进化出的抵御外界逆境的手段，这与包赛很那等[20]对劲直黄芪(AstragalusstrictusR. Grah. ex Benth.)根浸提液对 8 种西藏野生植物化感作用的研究一致。而石榴叶中有效化感物质的成分，如前言所述，推测为单宁类，而众多研究表明，单宁可影响多种酶活性，进而抑制植物生长[21-23]。质量浓度为0.005 g·mL-1的石榴叶浸提液对草种的种子萌发有促进作用或较弱的抑制作用，0.05 g·mL-1浸提液则有较强的抑制作用，对各幼苗根长和芽长的化感影响也有上述相似趋势，反映出化感物质具有质量浓度效应。这与刘雅婧等[21]所研究的狼毒(EuphorbiafischerianaSteud.)提取液对披碱草(ElymusdahuricusTurcz.)、冰草(Agropyroncristatum(L.) Gaertn.)的影响，以及张玥等[24]所研究的北美车前(PlantagovirginicaL.)和野胡萝卜(DaucuscarotaL.)浸提液对同种植物幼苗生长的影响基本一致，出现这种“低促高抑”的现象。这可能是石榴叶水浸提液含有的化感物质尚未达到影响的阈值，从而使部分指标在低质量浓度处理时表现出不明显的抑制作用；或是低质量浓度浸提液的弱胁迫刺激了幼苗的抗性，反而致使其活力提高，表现出化感促进作用[25]。

从本研究中可看出，石榴叶水提液对6种受体植物萌发指数的化感抑制作用大于对发芽率的影响，可能是萌发指数作为衡量化感作用的指标相比于发芽率更敏感[26]，在本试验中豆科牧草毛苕子该现象表现得更明显。本试验中毛苕子的种子发芽率和发芽势随着石榴叶水提液质量浓度加大而增加，而其萌发指数却表现出明显的抑制效应，这说明石榴叶的水提液对牧草毛苕子种子萌发有化感作用，可能其种子个体大活力足，即使本试验中设置的最高质量浓度浸提液(0.05 g·mL-1)对其而言也只是相对低质量浓度，如上所述只能刺激其抗性增加，活力提高。这种现象会影响果园生草中牧草种子的发芽整齐性，延迟种子发芽时间，导致出苗不齐，从而影响牧草对地上和地下资源的竞争能力[27]。同样，石榴叶水浸提液对6种受体植物幼苗生长阶段的化感作用大致表现为，对幼苗根长的抑制作用大于对芽长的影响，对幼苗鲜质量的抑制作用大于对干质量的影响。造成这一现象的原因可能为，相比于幼苗地上部分，幼苗根系则是直接接触的浸提液，因而所受到的化感影响更直接、更强烈[28-29]。种子萌发期的胚根生长对于其后期根系形态建成至关重要[30]，牧草根系受到抑制会导致其对养分和水分的吸收能力降低，进而致使生长发育受阻、植株矮小，最终影响牧草在石榴林下的正常生长。

本试验初步探讨得出在3种不同质量浓度下石榴叶水浸提液对6种常见牧草的萌发及幼苗生长存在不同强度的化感作用，依据总化感效应指数综合对比6种牧草所受化感抑制程度，由强到弱依次为毛苕子>白三叶>黑麦草>鸭茅草>红三叶>狼尾草。因此，在石榴果园套种牧草时应充分考虑林草间化感作用。本研究仅是石榴方面化感作用的初步研究，以后还需要设置更细、更广质量浓度范围，并结合大田试验深入研究。