红瓤核桃遗传和生物学特性观察及种仁品质分析

李琳，张港港，张燕，吴文江，赵伟，李文战，王磊,吴国良

(1.河南农业大学园艺学院，河南 郑州 450002；2.信阳农林学院，河南 信阳464000；3.河南农业大学农学院，河南 郑州 450046；4.河南省济源市鸿润苗木科技有限公司，河南 济源 459001)

核桃(JuglansregiaL.)为胡桃科胡桃属植物。依据种皮的颜色，中国核桃分为普通核桃(种仁呈黄白色)、紫仁核桃[1-2]、乌仁核桃[3]、红仁(红瓤)核桃[4-5]等类别。与美国红核桃(Juglansregia‘Robert Liver more’)不同的是，中国红瓤核桃种皮、果皮、叶片及木质部等组织均呈红色，是特异的核桃种质资源[6]。据文献记载，红瓤核桃典型的生物学性状是新梢的表皮、韧皮部、嫩芽、复叶、果皮和核桃仁种皮均为红褐色，主要分布于中国南太行山区及秦巴山区等地[7-8]。研究表明，红瓤核桃呈色的原因是由于花青苷(anthocyanin)的积累[9]。花青苷是植物体内重要的次生代谢物，作为天然色素广泛分布于植物多种组织器官中，是使植物组织呈现红、黄、蓝、紫等多种颜色的重要色素。花青苷的生物合成受内在因素(主要是内源糖信号和激素)、环境因素(如温度、光照等)以及一系列酶反应和转录因子的调控[10]。花青苷在避免植物受到紫外线伤害、吸引昆虫传粉和抵御低温胁迫等方面起着重要的作用[11-12]。其次，人体摄入果实中的花青苷可以有效地改善血糖平衡，预防心脑血管疾病[13]。此外，富含花青苷的红色种皮不仅能够提高坚果营养价值，也有助于改善核桃种仁的外观品质，符合国人喜好，经济效益相当可观。针对中国核桃栽培与生产过程中存在品种单一、附加值较低等问题，选用具有特殊功能或利用价值的优良品种是国内核桃产业未来的发展方向之一[14-15]。针对珍稀核桃种质资源的研究，国内除河南农业大学核桃种质资源创新与开发利用课题组的研究之外[6,10,16-17]，目前仅对红瓤核桃引种繁育[18-19]及彩色核桃品种选育和干旱胁迫有少许报道[1-3]，尚未见有红瓤核桃较系统的研究报告。

本研究以红瓤核桃为研究材料，连续3 a播种红瓤核桃种子，观察其幼苗叶色变化及分离比率，并且以普通核桃‘中林1号’为对照，定期观察高接大树的物候期、树体特征和果实形态特征；分析种仁的脂肪等多种营养成分。通过对以上材料的综合分析，旨在探讨中国红瓤核桃的育种、栽培利用价值和营养保健价值，为核桃新品种的培育提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

河南农业大学核桃种质资源创新与开发利用课题组于2017—2019年连续采集生长于南太行山区的野生资源红瓤核桃(JuglansregiaL.RW-1)果实，资源编号(JUREG4108210002)，秋季(9月中旬)带果皮播种于河南农业大学园艺学院果树资源圃。2016年冬季在原地野生大树上采集接穗，以普通核桃为砧木进行高接，对照为普通核桃‘中林1号’(为了与实生红瓤核桃分化出的绿苗区分而以此称呼)，均定植于河南农业大学园艺学院果树资源圃，南北向定植，株行距2 m×3 m，肥水按常规管理。2019年9月中旬果实成熟时从红瓤核桃和普通核桃树上依东、南、西、北、顶部随机选取中等大小果实30个，采摘后及时置于冰盒中带回实验室；分别在叶片发育早期T1(2019-04-06)、叶片发育中期T2(2019-05-28)和叶片发育后期T3(2019-06-28)采集红瓤核桃和红色实生苗叶片，于常温冰箱保存，用于后续试验。

1.2 研究内容及方法

1.2.1 红瓤核桃实生苗状况调查分析 播种当年采收的新鲜红瓤核桃果实点播，播深10 cm，株距25 cm，‘中林1号’种子作对照。在幼苗萌芽后调查出苗率，2017—2019年调查叶色分离情况，7月中旬新梢旺长期结束时调查生长指标，苗高为地面到顶芽处高度，苗粗为距地面5 cm处直径。观测连续进行4 a。

1.2.2 物候期及树体生长特性观察 核桃物候期观察期限为萌芽至树叶落完为止，花期每隔3 d观察1次，其他性状每隔7 d观察1次。观察标准为萌芽期：树上25%芽鳞片裂开，露出手握状密生茸毛的复叶原始体；展叶期：50%以上的枝条叶序全伸出，复叶全展开；雄花期：初花，有50%以上的雄花序看到花药，呈绿色。盛花，花序基本停止生长，萼片张开，可清楚看到杏黄色花药；雌花期：初花，50%以上雌花柱头已伸出，其表面呈羽毛状突起，分泌黏液；果实膨大期：果实体积快速增长时；果实硬核期：果实的核仁开始变硬时；果实成熟期：全株有25%以上的果实外果皮变黄开裂；落叶期：全树25%以上复叶脱落。核桃物候期观察自2016年开始至2021年。2019—2020年对红瓤核桃和普通核桃‘中林1号’的树形、树势、树高、2 a生枝的长度和粗度、新梢的长度和粗度以及枝条颜色和叶片颜色等生物学特性进行观察记录。

1.2.3 果实品质及种仁营养成分分析 果实的横纵侧径、壳厚采用游标卡尺测定，青果质量、坚果质量、鲜仁质量采用电子天平测定。出仁率=鲜仁质量/坚果质量×100%、果形指数=纵径/横径。对采集的红瓤核桃和普通核桃种仁内蛋白质、脂肪、维生素E、蔗糖、不饱和脂肪酸进行测定，每个指标测定3次，取平均值。蛋白质测定采用GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》[20]中的凯氏定氮法；脂肪含量测定采用GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》[21]的索氏提取法；不饱和脂肪酸含量测定采用GB 5009.168—2016《食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定》[22]的方法；维生素E含量测定采用Vitamin E assay kit试剂盒(百奥莱博，北京)；蔗糖含量测定采用Sucrose measurement kit试剂盒(百奥莱博，北京)。

1.2.4 花青苷含量测定 以红瓤核桃、普通核桃‘中林1号’种皮为材料，将所有样品真空冷冻干燥后研磨成粉末，随后称取100 mg的粉末溶解于1.0 mL提取液(质量分数70%甲醇)中，4 ℃冰箱过夜，其涡旋3次。经离心(1 000 g，10 min)后，吸取上清,用微孔滤膜(0.22 μm)过滤样品，并保存于进样瓶中，用于LC-MS/MS分析。采集不同生长发育时期红瓤核桃自然杂交后代性状分离的实生苗红叶片，采用pH值示差法测定花青苷总含量。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel 2016软件进行数据处理，所有的指标测定均有3次重复，结果用测定指标的平均值±标准误表示，采用SPSS 20.0软件对试验数据进行统计处理、方差分析(P<0.05)和显著性分析，以及对不饱和脂肪酸含量、蛋白质含量、脂肪含量、蔗糖和维生素E含量进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 红瓤核桃实生苗的叶色分化

2017年秋季采收红瓤核桃新鲜果实于郑州地区，带果皮播种于郑州地区，大部分种子当年即萌芽出苗，次年个别部分出苗。红瓤核桃苗在次年全部出齐后，叶色出现了分化，大部分表现为与对照相同的纯绿色，少部分单株颜色性状与母体相同。调查结果(表1)显示，实生后代叶色分离程度很大，绝大部分幼苗叶色为绿色，仅少部分保持了母体的红色性状，数量为5%左右。红瓤核桃实生苗长势普遍弱于相应分化出的绿核桃及对照(表1，图1)。红瓤核桃的出苗率整体与对照品种无差异。

表1 红瓤核桃实生苗性状表现Table 1 The performance of seedling traits of red walnut

图1 红瓤核桃实生苗性状的分化及长势差异Fig.1 Differentiation and growth difference of seedling traits of red walnut

在红瓤核桃自然杂交后代的实生苗中，叶片表现为红色的实生苗，其生长发育趋势与母本基本相同。在生长初期的红叶实生苗嫩芽、叶片和幼茎均表现为红色。随着幼苗的生长发育，红色叶片逐渐变为红绿色相调和，最后叶片完全变为深绿色，唯叶背的叶脉呈色仍显示红色。这与母本叶片颜色变化趋势相同(图2)。根据母本红瓤核桃叶片的采集时间，对红叶实生幼苗的各个发育时期进行采样，测定不同时期实生红色叶片的总花青苷含量，参照前期研究结果[9]发现，子代实生红色叶片中的花青苷含量变化趋势与母本相同。随着幼苗生长发育成熟，叶片中的花青苷含量逐渐下降。这与叶片从全红色变为深绿色的表型特征相一致。红瓤核桃自然杂交后代实生红色叶片中的花青苷总含量显著高于母本叶片中的花青苷总含量。这说明实生后代幼苗叶色为红色的植株，不仅保持了母本的红色性状，而且叶片中所含有的花青苷总含量有显著增高。

*和**表示在P<0.05 和P<0.01 水平差异显著。下同。* and ** mean significant differences at P<0.05 and P<0.01 levels,respectively.The same as below.

2.2 红瓤核桃和普通核桃物候期分析

2021年物候期观察结果显示，红瓤核桃生育期为221 d，比普通核桃‘中林1号’(CK)短7 d，萌芽期为3月中旬，比‘中林1号’晚约5 d，果实9月中旬成熟，比‘中林1号’晚4 d，其他物候期比‘中林1号’晚1～9 d，表明红瓤核桃为晚实品系。该类型花期为雄先型，雌雄花盛开期相差7 d左右(表2)。由于物候期较晚，尤其是雌花盛花期比对照晚5 d，在作为资源培育晚花品系来预防晚霜方面具有一定潜力。

表2 2021年红瓤核桃和普通核桃物候期Table 2 Phenology of red walnut and common walnut in 2021 year 月-日

2.3 红瓤核桃和普通核桃树体特征分析

本研究通过2019年和2020年观察，对红瓤核桃和普通核桃‘中林1号’的树型、树高、树势、新梢、2 a生枝生长情况等生物学特性进行比较(表3)，发现红瓤核桃树体高度为(281.10±0.03)cm，2 a生枝条长度为(63.15±15.20)cm，粗度为(1.07±0.11)cm，新梢长度为(37.62±6.80)cm，粗度为(0.66±0.04)cm，其树体、枝条等生长量均明显小于普通核桃。红瓤核桃枝条颜色为灰褐色，叶片、雄花、雌花、果实及种仁颜色均为红色(图3)，包括木质部也有色素积累。但随着植株生长发育和果实的成熟，红色叶片逐渐变为深绿色或绿褐色，而果皮则呈现红褐色，种皮呈现深红色。

表3 红瓤核桃和普通核桃树体特征Table 3 Tree characteristics of red walnut and common walnut

2.4 果实品质及种仁营养成分

为了评价红瓤核桃的果实品质，对红瓤核桃和对照品种‘中林1号’分别采取30个果实，对青果质量、坚果质量、纵横侧径、壳厚、鲜仁质量、出仁率、果形指数和种皮颜色等进行了比较分析。结果表明，红瓤核桃青果质量为(32.6±1.3)g，坚果质量为(11.5±1.0)g，坚果纵径为(28.8±1.0)mm，横径为(27.3±1.1) mm，侧径为(30.1±3.0)mm，果形指数为1.1，坚果壳厚为(1.1±1.0)mm，鲜仁质量为(5.6±0.5) g，出仁率为48.7%。红瓤核桃取仁易，能取整仁，比普通核桃的出仁率低4.6%；种皮颜色为深红色，说明红瓤核桃种仁花青苷含量要高于普通核桃‘中林1号’，但由于其果壳稍厚于对照，故其出仁率较低，但内折壁和隔膜并非很发达，所以较易取整仁(表4)。

表4 红瓤核桃和普通核桃果实表型特征Table 4 Fruit phenotypic characteristics of red walnut and common walnut

花青苷是一种在色素沉淀中起重要作用的次生代谢产物[23]。红瓤核桃果仁外包被着一层深红色的种皮，测定种皮内的花青苷含量后分析发现，红瓤核桃种皮内富含飞燕草素、矢车菊素、天竺葵色素、矮牵牛素、锦葵色素和芍药花色素，与普通核桃‘中林1号’相比差异显著。红瓤核桃种皮中矢车菊素含量最高，为(6.15×10-3±0.70×10-3)mg·g-1约为普通核桃的399倍；其次为飞燕草素含量为(9.01×10-4±1.47×10-4)mg·g-1，约为普通核桃的4倍；芍药花色素含量为(6.24×10-6±0.91×10-6)mg·g-1，约为普通核桃的8倍；天竺葵色素含量为(5.93×10-6±0.62×10-6)mg·g-1，约为普通核桃的27倍；锦葵色素含量为(4.16×10-6±1.02×10-6)mg·g-1，约为普通核桃的9倍；矮牵牛素含量为(2.89×10-6±0.51×10-6)mg·g-1，约为普通核桃的8倍(表5)。

表5 红瓤核桃和普通核桃种皮花青苷含量Table 5 Relative amount of anthocyanin in inner seed coat of red walnut and common walnut kernel mg·g-1

核桃坚果品质主要与脂肪、蛋白质、主要脂肪酸含量密切相关[24]。种仁中的脂肪、蛋白质、蔗糖和维生素E的测定结果表明，红瓤核桃种仁中的脂肪含量为(522.36±2.40)g·kg-1，比‘中林1号’高4.03%；蛋白质含量为(179.51±3.21)g·kg-1，比‘中林1号’低0.17%；蔗糖含量为(53.78±0.79)mg·g-1，比‘中林1号’高出4.75%；维生素E含量为(372.04±0.21)mg·g-1，比‘中林1号’低7.62%(表6)。脂肪酸作为便于吸收的重要的营养物质对人体具有重要作用[25]，红瓤核桃和普通核桃‘中林1号’脂肪酸中的主要成分一致，均以不饱和脂肪酸(89.746%和88.813%)为主，其中亚油酸含量最多(69.342%和62.263%)，其次为油酸(11.742%和20.095%)和α-亚麻酸(8.156%和5.887%)(表7)。

表6 红瓤核桃和普通核桃种仁营养成分Table 6 Nutritional composition of red walnut kernel and common walnut kernel

表7 红瓤核桃和普通核桃种仁脂肪酸含量Table 7 Fatty acid content of red walnut kernel and common walnut kernel

2.5 红瓤核桃果实品质指标的相关性

由红瓤核桃果实主要营养成分相关性分析结果(表8)可知，红瓤核桃果实营养成分间存在一定相关性。其中不饱和脂肪酸与脂肪、蛋白质、维生素E呈一定的正相关关系，而与蔗糖含量呈一定的负相关关系；脂肪与蛋白质、蔗糖呈正相关关系，与维生素E呈负相关关系；蛋白质与维生素E、蔗糖呈正相关关系；维生素E与蔗糖呈显著负相关关系。

表8 红瓤核桃种仁营养成分相关性分析Table 8 Correlation analysis of nutritional components in red walnut kernel

2.6 果实品质主成分分析

对红瓤核桃和普通核桃果实营养成分指标进行主成分分析后，提取到4个主成分，累计的方差贡献率达到99.99%(表9)。其中，第1和第2主成分的特征值分别为2.961和1.958，贡献率分别为59.212%和39.165%，前2个主成分的累积贡献率已达到98.377%(超过80%)，可以反映大部分的信息，所以提取前2个主成分用作综合评价(表10)。

表9 主成分特征值Table 9 Principal components eigenvalues

经SPSS数据主成分分析得到主成分载荷矩阵。主成分的载荷矩阵旋转之后系数更接近1或更接近0，这样得到的主成分可以更好地解释和命名变量。主成分1主要携带的是不饱和脂肪酸、脂肪和蛋白质的信息，主成分2主要携带维生素E和蔗糖(表10)。综合评价红瓤核桃果实营养成分综合评分更高，说明红瓤核桃具有较高的营养价值。

表10 主成分初始因子载荷矩阵Table 10 Principal components initial factor load matrix

3 讨论与结论

红瓤核桃是颇具特色的珍稀核桃种质资源。本团队前期对红瓤核桃叶片性状及光合日变化、色素代谢相关基因进行了分析鉴定[9,10,16-17]，在此基础上对其实生后代叶色分离情况、生长习性和主要物候期、种仁营养品质成分进行了综合分析。

3.1 关于实生后代叶色分离现象

虽然红瓤核桃在核桃志中早有记载[7]，但其性状研究和开发利用却近乎空白。本团队在承担国家核桃资源调查项目过程中，对其单系进行了调查和资源登录，依照核桃志的描述仍记载为红瓤核桃，登录号为JUREG4108210002，之后以此为材料开展了与核桃色素代谢相关的基础研究[26-28]。

核桃为异花授粉果树，其遗传背景较为复杂。有关核桃重要性状遗传方式的资料较少[29]，而红瓤核桃性状的遗传仅见有美国红仁核桃的介绍[4]，其中谈到了控制红色的基因为显性的R基因。但美国红仁核桃除种皮为红色外，其余性状均与普通核桃相同，而中国红瓤核桃则通体呈红色，其遗传机制应完全不同。这两类红核桃的来源不同，前者为人工杂交育成(亲本为‘霍德华’与‘RA1088’)，后者为中国普通核桃的天然变异株。据调查秦巴山区原母株已丢失，南太行山区原母株野外目前仅存活2株。假设该红色性状为隐性单基因所控制，只有在隐性纯合情况下后代才能呈现红色性状，以目前的分离比例看，远远不符合单基因作用规律。因此，可以推断中国红瓤核桃的呈色机制比较复杂，或是多基因互作起作用的[10]。

对红瓤核桃自然杂交后代红色实生幼苗进行观察，其表型特征与母本叶片的颜色变化趋势相同，均在叶片发育初期表现为全红色。随着幼苗的生长发育，叶片颜色逐渐变为红绿相间，最后变为深绿色。实生后代中性状表现与母本相同的红色幼苗，其叶片中的花青苷总含量显著高于母本叶片中的花青苷总含量。这说明在自然杂交后代红叶实生幼苗中，花青苷的总含量是显著增高的，为后续培养高花青苷含量的杂交后代提供理论依据，而花青苷含量也与花青苷合成相关的基因及转录因子有很大的关系，需要进一步的分析验证。

3.2 关于红瓤核桃的生物学特性

观察发现，红瓤核桃为晚实类品系，花期为雄先型，雌雄花盛开期相差约7 d，与普通核桃相比萌芽较晚，生育期为221 d。由于原母株来源于中国北方晚实核桃主产区，该单株的结实特性亦属于晚实类。红瓤核桃的树高小于普通核桃树，长势较弱，枝条颜色为灰褐色，叶片、雄花、雌花、果实及种仁颜色均为红色，但随着植株生长发育和果实的成熟，红色叶片逐渐变为绿色，而其果皮、种皮则一直呈现红色。作为核桃育种的特异的原始材料，保留红色性状而改变其他性状，这或许是未来红瓤核桃育种最有潜力的研究方向。

3.3 关于红瓤核桃的色素及营养价值

核桃本身应用价值就很高，而红瓤核桃通体富含花青苷，尤其是果仁呈红色，长期摄入对身体也有好处。不但可以抗氧化、抑制炎症、改善视力，还能预防慢性病的发生和发展[12]。红瓤核桃种皮中含量较高的花青苷为矢车菊素和飞燕草素，与普通核桃相比差异显著，尤其是矢车菊素的含量是普通核桃的399倍。坚果营养成分主要包括脂肪、蛋白质、蔗糖、维生素E、脂肪酸等。对果实营养成分指标进行主成分分析，发现主成分1主要携带的是不饱和脂肪酸、脂肪和蛋白质的信息。脂肪酸，尤其是不饱和脂肪酸，是衡量果实品质的重要指标[30]，而不饱和脂肪酸中的亚油酸、油酸和α-亚麻酸的组成比例，对于维持人体生理平衡有重要作用[31]，是优质脂肪酸的判断依据。红瓤核桃中不饱和脂肪酸含量较高，其中亚油酸含量最多，其次为油酸和α-亚麻酸；红瓤核桃的脂肪含量显著高于普通核桃，蛋白质含量较低。主成分2主要携带维生素E和蔗糖，红瓤核桃蔗糖含量显著高于普通核桃，而作为核桃第二大营养成分的蛋白质含量与普通核桃相差不大[32]。

红瓤核桃果实品质优良，种仁外观颜色红亮，具有较高的经济价值[9]。但红瓤核桃果实较普通核桃体积偏小、树势较弱是影响红瓤核桃经济效益的关键问题。目前，红瓤核桃通过高接在普通核桃上，其果实生长状况稍逊于‘中林1号’。但从开发利用特异资源的角度考虑，红瓤核桃具有潜在的利用价值。因其各组织中含有较高的花青苷，花青苷在影响果实呈色的同时，对植株起到光保护的作用[23]，而且，红瓤核桃的木质部也含有较高的色素，使得木质部呈现宜人的红色，这为核桃木材加工利用展示了新的内容。已有研究表明，红瓤核桃虽富含花青苷，但其净光合速率低于普通核桃[16]，部分彩叶植物光合效率低于绿叶植物，如紫甘蓝[24]、中华红叶杨[25]、Rutgers桃(红叶)[33]等植物的相关研究也都证实了这一观点。花青苷通过吸收红色光谱，从而减弱了到达植物细胞内部的光照度[23]。与此同时，花青苷能够减少到达光合复合体的光[31]，从而影响了植物的光合作用，导致植株生长缓慢，果实产量降低，体积偏小。因此认为花青苷的存在吸收和耗散了一部分光能，使得光合作用所能利用到的光能减少，从而降低了光合效率，进而影响了植株的生长发育和果实的大小。这可能也是红瓤核桃比普通核桃树势弱的原因之一。因此，提高红瓤核桃的光合效率是红瓤核桃品系选育中的关键基础问题之一。

本研究通过对红瓤核桃和普通核桃的树体特征和果实品质进行对比分析，进一步了解了红瓤核桃的生长特性和果实营养成分的组成和含量，为红瓤核桃的选育和改良提供了理论基础。红瓤核桃实生后代叶色分离严重，呈现红色的后代比例仅约5%。红瓤核桃的叶片、果皮、种皮及木质部等组织均呈红色，是颇具特色的珍稀核桃种质资源。红瓤核桃营养成分含量高，种仁中脂肪含量、蔗糖含量及不饱和脂肪酸含量均高于普通核桃，蛋白质含量相当，种皮中的花青苷含量丰富，具有一定的食疗保健价值和广阔的市场发展前景。