微小RNA-152-3p对结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其作用机制研究

2022-08-31 02:04王磊郑广涛
安徽医药 2022年9期
关键词:荧光素酶细胞周期结肠

王磊,郑广涛

结肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤,因其早期病症隐匿,部分病人发现时已出现肝脏转移,化疗是其重要治疗方法。然而,化疗具有一定局限性,而分子靶向药物治疗可以能够特异性阻止结肠癌细胞增殖并不损伤正常细胞,可延长结肠癌病人的生存期,提高病人的生命质量[1]。微小RNA(miRNA,miR)是由20 个左右核苷酸组成的内源性单链RNA小分子,许多研究表明多种miRNA的异常表达与结肠癌的进展关系密切[2]。有研究报道miR-152-3p 能抑制人胃癌SGC-7901 细胞增殖并诱导细胞凋亡[3];上调miR-152 可逆转膀胱癌细胞EMT,从而降低膀胱癌生长、侵袭和迁移的风险[4]。miR-152在结直肠癌组织中的低表达,与结直肠癌病人的淋巴结转移和TNM 分期有关[5]。转移相关蛋白2(metastasis-associated gene2,MTA2)是MTA 家族重要成员之一,研究发现MTA2在结肠癌组织中表达较高,与肿瘤的临床分期、分化程度等密切相关[6]。过表达MTA1 通过促进MTA2 降解在体外抑制乳腺癌ZR-75-30 细胞的转移[7]。但miR-152-3p 对结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其作用机制是否与MTA1 相关尚未可知,本研究于2019 年2 月至2020年4月通过体外细胞实验揭示miR-152-3p对结肠癌细胞的影响及其机制是否与MTA1有关。

1 材料与方法

1.1 材料结肠癌细胞LoVo、HCT116、SW480和人正常结肠上皮细胞NCM460,中国典型培养物保藏中心;荧光定量试剂、Trizol 试剂盒,美国Alpco 公司;RPMI-1640 培养基,美国Gibico 公司;噻唑蓝(MTT)试剂盒,美国Sigma 公司;放射免疫沉淀法(RIPA)蛋白裂解液,南京凯基生物公司;双荧光素酶报告基因检测试剂盒,碧云天。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组 以含胎牛血清的RPMI-1640 培养基培养结肠癌细胞HCT116、LoVo、SW480和人正常结肠上皮细胞NCM460;取对数生长期SW480 细胞,无血清培养后进行转染,转染分为miR-152-3p 模拟物阴性对照(miR-NC)组、miR-152-3p 模拟物(miR-152-3p)组、抑制物(anti-miR-NC)组、miR-152-3p 抑制物(anti-miR-152-3p)组、阴性对照(si-NC)组、沉默转移相关蛋白2(si-MTA2)组、miR-152-3p 模 拟 物+ 空 载 体(miR-152-3p+pcDNA3.1)组、miR-152-3p 模拟物+过表达MTA2(miR-152-3p+pcDNA3.1-MTA2)组,另取未转染结直肠癌SW480细胞记为Control组。

1.2.2 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRTPCR)检测miR-152-3p 和MTA2 mRNA 表达水平提取细胞总RNA,逆转录为互补DNA(cDNA),定量,相对表达量以β肌动蛋白(β-actin)为内参。

1.2.3 蛋白质印迹法测定蛋白的表达 提取总蛋白,行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE),移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,脱脂奶粉室温封闭膜1 h,将膜至于稀释的一抗溶液中4 ℃孵育过夜,再用稀释的二抗室温孵育膜2 h。显影定影,对蛋白条带进行吸光度分析,计算蛋白表达水平。

图3 过表达miR-152-3p和沉默转移相关蛋白2(MTA2)对结肠癌细胞SW480迁移和侵袭的影响(结晶紫染色×200)

1.2.4 MTT 法检测细胞增殖 各组细胞均培养48 h,参照试剂盒指南,用酶标仪测490 nm处吸光度。

1.2.5 Transwell 检测细胞迁移和侵袭 迁移:Transwell上室加200 μL 悬液,下室加培养液,温育24 h,甲醛、结晶紫固定染色后,显微镜下细胞计数。侵袭:Matrigel包被Transwell上室,其余步骤同迁移。

1.2.6 荧光素酶报告基因检测实验 构建MTA2 的3′非翻译区(3′-UTR)野生型和突变型荧光素酶载体(MTA2-WT 和MTA2-MUT),将其分别与miR-NC及miR-152-3p 共转染至SW480 细胞中;依报告指南测荧光素酶活性。

1.3 统计学方法采用SPSS 20.00 进行统计学分析。计量资料以± s表示,两组间比较行两独立样本t 检验;多组间比较采用单因素方差分析,进一步多组间的两两比较采用SNK-q 检验。以P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-152-3p 在结肠癌细胞中表达下调,MTA2表达上调与正常结肠上皮细胞NCM460 相比,结肠癌细胞HCT116、LoVo、SW480 中MTA2 mRNA 和蛋白较高,miR-152-3p 较低(P<0.05),选择MTA2 和miR-152-3p 表达较NCM460 细胞差异最明显的结肠癌SW480进行后续实验。见图1,表1。

图1 人正常结肠上皮细胞NCM460与结肠癌细胞LoVo、HCT116、SW480中MTA2蛋白表达

表1 人正常结肠上皮细胞NCM460与结肠癌细胞LoVo、HCT116、SW480中miR-152-3p和MTA2表达水平比较/± s

表1 人正常结肠上皮细胞NCM460与结肠癌细胞LoVo、HCT116、SW480中miR-152-3p和MTA2表达水平比较/± s

注:MTA2为转移相关蛋白2。①相比NCM460 细胞,P<0.05。②相比HCT116 细胞,P<0.05。③相比SW480细胞,P<0.05。

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2.2 过表达miR-152-3p和沉默MTA2对SW480细胞增殖的影响转染miR-152-3p mimics 的SW480细胞中miR-152-3p 表达水平显著高于转染miR-NC的细胞(3.53±0.12 比1.03±0.05,t=33.31,P<0.05),转染si-MTA2 的SW480 细胞中MTA2 蛋白表达显著低于 转 染si-NC 的 细 胞(0.33±0.03 比0.99±0.08,t=13.39,P<0.05),说 明 过 表 达miR-152-3p 或 沉 默MTA2的SW480细胞构建成功。

与miR-NC 组 相 比,miR-152-3p 组SW480 细 胞中细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、SW480 细胞活性较低,周期素依赖激酶抑制剂p21(P21)较高(P<0.05);与si-NC组相比,si-MTA2组SW480细胞中cyclin D1表达较低,P21表达较高,SW480细胞活性较低(P<0.05)。见图2,表2。

2.3 过表达miR-152-3p和沉默MTA2对SW480细胞迁移和侵袭的影响与miR-NC组相比,miR-152-3p 组SW480 细胞中上皮钙黏素(E-cadherin)较高,基质金属蛋白酶(MMP)-2 较低,SW480 细胞迁移和侵袭数量较低(P<0.05);与si-NC 组相比,si-MTA2组SW480 细胞中MMP-2 表达较低,E-cadherin 表达较高,SW480 细胞迁移和侵袭数量显著降低(P<0.05)。见图3,4;表3。

表2 过表达miR-152-3p或沉默MTA2对结肠癌细胞SW480增殖的影响/± s

表2 过表达miR-152-3p或沉默MTA2对结肠癌细胞SW480增殖的影响/± s

注:MTA2 为转移相关蛋白2,cyclin D1 为细胞周期蛋白D1,P21为周期素依赖激酶抑制剂p21。①相比Control 组,P<0.05。②相比miR-NC 组,P<0.05。③相比si-NC组,P<0.05。

组别Control miR-NC miR-152-3p si-NC si-MTA2 F值P值重复次数33 3 3 3吸光度0.92±0.22 0.96±0.17 0.31±0.07①②0.99±0.17 0.32±0.09①③15.62<0.001 cyclin D1蛋白0.85±0.07 0.87±0.09 0.36±0.03①②0.91±0.12 0.26±0.083①③42.39<0.001 P21蛋白0.34±0.03 0.36±0.04 0.65±0.09①②0.25±0.04 0.89±0.18①③23.73<0.001

图4 过表达miR-152-3p和沉默MTA2对结肠癌细胞SW480中MMP-2和E-cadherin蛋白表达表达的影响

2.4 miR-152-3p靶向调控MTA2表达TargetScan数据库分析显示MTA2 与miR-152-3p 存在结合位点;miR-152-3p 与MTA2-WT 共转染的SW480 细胞荧光素酶活性降低(0.43±0.03 比1.10±0.15,t=7.59,P=0.002);而miR-152-3p 与MTA2-MUT 共 转 染 的SW480 细胞的荧光素酶活性差异无统计学意义(0.92±0.09 比1.13±0.14,t=2.19,P=0.094)。过表达miR-152-3p,MTA2 表达水平显著降低;抑制miR-152-3p 表达,MTA2 表达水平显著升高(P<0.05)。见表4。

表4 miR-152-3p对MTA2 mRNA和蛋白表达的影响/± s

表4 miR-152-3p对MTA2 mRNA和蛋白表达的影响/± s

组别miR-NC miR-152-3p anti-miR-NC anti-miR-152-3p F值P值重复次数3 3 3 3 MTA2 mRNA 0.99±0.03 0.23±0.02①0.98±0.02 3.61±0.10②2 251.79<0.001 MTA2蛋白0.92±0.09 0.40±0.02①0.92±0.11 1.78±0.18②74.05<0.001

注:MTA2为转移相关蛋白2。
①相比miR-NC组,P<0.05。②相比anti-miR-NC组,P<0.05。

2.5 过表达MTA2 逆转过表达miR-152-3p 对结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用相比miR-152-3p+pcDNA3.1 组,miR-152-3p+pcDNA3.1-MTA2组SW480 细胞中P21、E-cadherin 的表达较低,MTA2、cyclin D1、MMP-2蛋白的表达较高,SW480细胞活性、迁移、侵袭数量较高(P<0.05),见表5。

3 讨论

结肠癌发病率和病死率均较高,对人类健康危害极大,分子靶向治疗是一种新的方法,已取得一些成果,但仍有待深入研究[8-9]。miR-152 在多种肿瘤中可作为一种肿瘤抑制因子,如miR-152-3p 在胶质瘤细胞中低表达,过表达miR-152-3p 显著诱导细胞凋亡并抑制侵袭活性[10]。miR-152-3p 还能抑制前列腺癌细胞活力和侵袭潜力[11];上调miR-152-3p表达可抑制心肌细胞凋亡[12]。本研究显示,miR-152-3p 在结肠癌细胞低表达,miR-152-3p 过表达对SW480细胞增殖迁移及侵袭起抑制作用。

MTA2 转移相关基因,在肿瘤中多作为致癌基因,可作为诊断和治疗肿瘤的靶点。下调MTA2 的表达抑制了胃癌的侵袭及转移[13];稳定干扰MTA2有效抑制了乳腺癌的增殖、转移[14]。MTA2 在结肠癌组织中表达水平显著高于癌旁组织,与肿瘤的分化程度、临床分期、淋巴结转移有关,提示MTA2 与结肠癌恶性程度有关,对结肠癌的侵袭转移起促进作用,参与结肠癌的发展过程[15]。本实验结果同样表明,MTA2 在结肠癌细胞高表达,沉默MTA2 能抑制SW480 细胞增殖、迁移和侵袭。且miR-152-3p 靶向调控MTA2,过表达MTA2 逆转了miR-152-3p 对SW480细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用。

E-cadherin 是上皮屏障和侵袭抑制因子,其下调表达会导致上皮细胞去分化和高度浸润从而有利于肿瘤细胞的侵袭转移;MMP 是一种蛋白水解酶,MMP-2 是其家族的一员,与结肠癌的侵袭转移相关[16-17]。本研究结果显示,过表达miR-152-3p 和沉默MTA2 对MMP-2 表达起抑制作用,对E-cadherin 表达起促进作用,提示其可抑制结肠癌侵袭转移。cyclin D1 是细胞周期正调控因子,高表达促进细胞增殖,P21 是细胞周期的负调控因子,促进p21表达,进而抑制cyclin D1 表达,可抑制结肠癌细胞增殖[18-19]。本研究结果显示,过表达miR-152-3p 和沉默MTA2 抑制了cyclin D1 的表达,促进了P21 的表达,表明其可抑制结肠癌的恶性增殖。

综上,miR-152-3p 能抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭,其机制可能与MTA2有关。

表3 过表达miR-152-3p和沉默MTA2对结肠癌细胞SW480迁移、侵袭及MMP-2和E-cadherin蛋白表达的影响/± s

表3 过表达miR-152-3p和沉默MTA2对结肠癌细胞SW480迁移、侵袭及MMP-2和E-cadherin蛋白表达的影响/± s

注:MTA2为转移相关蛋白2,MMP-2为基质金属蛋白酶-2,E-cadherin为上皮钙黏素。①相比Control组,P<0.05。②相比miR-NC组,P<0.05。③相比si-NC组,P<0.05。

组别Control miR-NC miR-152-3p si-NC si-MTA2 F值P值重复次数33333细胞迁移数/个172.00±23.52 169.00±20.66 53.67±12.22①②155.67±16.8 54.33±8.74①③38.02<0.001细胞侵袭数/个124.67±10.02 122.33±9.45 26.00±5.00①②108.33±10.02 42.00±4.00①③100.13<0.001 MMP-2蛋白0.92±0.09 0.96±0.10 0.47±0.04①②0.98±0.18 0.31±0.03①③27.98<0.001 E-cadherin蛋白0.43±0.03 0.48±0.03 1.09±0.16①②0.32±0.06 1.30±0.14①③57.43<0.001

表5 过表达MTA2逆转miR-152-3p对结肠癌细胞SW480增殖、迁移和侵袭及相关蛋白表达的影响/± s

表5 过表达MTA2逆转miR-152-3p对结肠癌细胞SW480增殖、迁移和侵袭及相关蛋白表达的影响/± s

注:MTA2为转移相关蛋白2,cyclin D1为细胞周期蛋白D1,P21为周期素依赖激酶抑制剂p21,MMP-2为基质金属蛋白酶-2,E-cadherin 为上皮钙黏素。

组别miR-152-3p+pcDNA3.1 miR-152-3p+pcDNA3.1-MTA2 t值P值重复次数33吸光度0.35±0.07 0.69±0.15 3.56 0.024细胞迁移数/个56.67±7.09 139.33±19.04 7.05 0.002细胞侵袭数/个40.00±5.29 117.67±10.6 11.36<0.001 MTA2蛋白0.43±0.06 0.99±0.14 6.37<0.001 cyclin D1蛋白0.42±0.06 1.35±0.07 17.47<0.001 P21蛋白1.13±0.11 0.46±0.06 9.26 0.001 MMP-2蛋白0.64±0.04 1.9±0.24 8.97 0.001 E-cadherin蛋白1.86±0.13 0.65±0.04 15.41<0.001

(本文图3见插图9-4)

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