粒细胞集落刺激因子对脑小血管病大鼠神经元活性、血管超微结构及神经元核抗原阳性表达的影响

席自中，宋彦，宋元贞，张依璐

脑小血管病（CSVD）是由颅内小血管（包括小动脉、微动脉、毛细血管、小静脉和微静脉）发生病理改变而引起的一组疾病。CSVD 的病理生理改变包括血管壁改变、血-脑脊液屏障功能受损、脑灌注下降、血管运动反应性降低、水肿、缺血、神经纤维脱髓鞘和小胶质增生等［1-2］。在影像学上，CSVD 可表现为腔隙性脑梗死、脑白质病变及脑微出血。卒中、痴呆、老龄化被认为是最常见的CSVD 发病危险因素，CSVD 会对血管壁造成一定的损伤，在脑室周围有大量的血浆蛋白进入，血-脑屏障发生障碍，进而导致腔隙性脑梗死等疾病的发生［3］。和其他类型的脑卒中相比，CSVD 所致的脑卒中虽然较轻，但长期的预后效果较其他类型的脑卒中相对较差。目前CSVD的发病率逐年增加，但治疗CSVD还没有更为有效的办法，因此治疗CSVD 的有效方法是当今临床上研究的热点。粒细胞集落刺激因子（G-CSF）是一种调节骨髓粒系造血细胞的细胞因子，其造血功能在中枢神经系统内尤为重要，G-CSF 及其受体在脑组织中大量存在［4-5］。有文献证实G-CSF 对缺血再灌注损伤大鼠的脑组织具有一定的保护作用，其作用机制是通过对血管内皮增生修复的有效促进来实现［6］。神经元核抗原（NeuN）是一种特异性蛋白质，存在脊椎动物神经系统中，主要表达于神经与细胞核和细胞浆中［7］。有学者研究发现，NeuN存在人早期胚胎的中枢神经系统中，在神经元大部分NeuN 呈高表达，少部分为低表达和阴性表达［8］。有关NeuN 在CSVD 中的分布未见报道，因此本研究于2020 年1 月至2021 年1 月探究G-CSF 对CSVD 大鼠神经元活性、血管超微结构和NeuN 阳性表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物本实验所用大鼠均从北京斯贝福实验动物可以有限公司购买，许可证号SCXK（京）2016-0002。SD 雄性大鼠40 只，24 周龄，清洁级，体质量范围为300～350 g。所有大鼠饲养在20～25 ℃的环境中，相对湿度保持在50%～65%，保持环境相对安静，12 h光照昼夜交替，大鼠自由进食摄水。本研究符合一般动物实验伦理学原则。

1.2 试剂和仪器本实验所有试剂和仪器分别为杭州九源基因工程有限公司生产的G-CSF 注射液；美国Vector 公司生产的小鼠抗大鼠NeuN 单克隆抗体；武汉塞维尔生物科技有限公司生产的兔抗GAPDH 抗体；艾比玛特德国LEICA 公司生产的LEICA CRYCUT1800 型冰冻切片机；日本奥林巴斯公司生产的FV1000 型荧光显微镜；武汉博士德生物公司生产的免疫组织化学试剂盒和苏木精-伊红染色（HE染色）试剂盒。

1.3 动物分组和CSVD 模型的制备采用随机数字表法将40 只大鼠分为假手术组10 只和模型组大鼠30只。将模型组大鼠制备CSVD大鼠模型。制备自体血浆：采取大鼠左心室血液，将血液经80 ℃高温干燥后研磨，在200 μm 的筛孔中过滤，制备成栓子，在造模时将栓子和盐水混合为混悬液。麻醉大鼠后，大鼠仰卧位固定于手术台，剔除颈部毛发后消毒，在正中位置切一小口，将左侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉钝性分离后暴露在外，在颈总动脉的近心端用动脉夹暂时夹闭，把颈外动脉远心端的位置结扎，将制备好的栓子混悬液由颈外动脉逆近心端逆向推注0.3 mL。将颈总动脉处夹子打开，恢复颈部血流让栓子从颈内动脉通过，进入到大脑前动脉、中动脉及大脑侧枝，将颈外动脉近心端结扎后缝合切口、消毒。造模成功标准：利用激光散斑成像技术检测假手术组和模型组脑血流量，模型组脑血流量较假手术组明显减少，表示造模成功［9］，同时记录大鼠死亡数量。在造模过程中模型组大鼠在手术过程中死亡6 只，在术后有4 只大鼠死亡，剩余20只造模成功。假手术组大鼠仅分离颈总、颈内和颈外动脉，不进行结扎，其余手术步骤同模型组相同。将20 只CSVD 造模成功大鼠平均分为CSVD模型组（CSVD 组）和CSVD 模型大鼠给予G-CSF 干预治疗组（G-CSF 组），每组10 只。造模成功后，将G-CSF 组大鼠经皮下注射G-CSF 50 μg/kg，1天1次；假手术组和CSVD 组大鼠均经皮下注射等量的生理盐水干预，1天1次，三组大鼠均连续注射7 d。

图1 各组大鼠海马组织病理学图片（苏木精-伊红染色×400）

图2 各组大鼠神经元细胞凋亡情况（TUNEL检测×400）

1.4 标本取材麻醉各组大鼠，将大鼠仰卧位固定手术台，打开胸腔将心脏充分暴露在外，将灌注针头经心尖缓慢插入到主动脉，止血钳夹紧后用生理盐水灌注，将大鼠右心耳剪开，发现流出的液体呈清凉时停止灌注；停止后将多聚甲醛注入，当发现大鼠的四肢变白、身体僵硬时断头处死大鼠，立即取出大鼠脑组织，分离额叶皮质脑组织用于电镜观察；剩下的脑组织用于HE 染色、NeuN 免疫组织化学染色及TUNEL染色。

1.5 HE 染色观察海马组织形态变化将三组大鼠分别麻醉致死，取出大鼠视交叉前后2 mm冠状切片组织块，将其固定于甲醛溶液中，用石蜡将组织包埋制成4 μm 石蜡切片，对切片进行HE 染色处理，用中性树胶对切片进行封片，显微镜下观察大鼠海马组织的病理学变化。

1.6 TUNEL 检测神经元细胞凋亡分别麻醉三组大鼠，断头处死后将大鼠的脑组织取出，用多聚甲醛将脑组织固定，经脱水、透明、包埋处理后，制成5 μm 的冠状切面，实验操作均按照TUNEL 试剂盒说明严格进行。细胞核中凋亡细胞为棕黄色，在显微镜下随机选取基底节不同区的3 个视野，计算细胞的凋亡率。凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.7 透射电镜观察微血管结构和内皮形态将额叶脑皮质制备成1 mm3的组织块，将组织固定后漂洗组织，经乙醇脱水、石蜡包埋后制成50～60 nm 的薄片；用醋酸铀一枸橼酸铅双染色，用透射电镜对切片组织进行观察。

1.8 免疫荧光染色检测NeuN表达水平分别麻醉三组大鼠，打开大鼠胸腔，将右心耳剪开后，将生理盐水从左心室缓慢灌注，当右心耳流出的液体为清凉时停止灌注，用250 mL 多聚甲醛继续灌注，灌注后取出大鼠脑组织，将海马区进行冰冻并切片。对切片进行高温抗原修复，常规画圈，把打孔液加入其中，15 min 后用山羊血液进行封闭，1 h 后将NeuN一抗加入，4 ℃环境孵育过夜后，对组织进行清洗，将山羊抗兔TgG 二抗加入，在室温下孵育2 h，磷酸缓冲盐溶液（PBS）对组织再次清洗，用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对切片组织进行复燃，15 min后用甘油将组织封边。每只大鼠各随机选取1张切片进行观察，对阳性细胞数计数。

1.9 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测NeuN 和VEGF mRNA 表达分别麻醉三组大鼠，断头处死后将海马组织取出，用Trizol 裂解液对总的RNA 进行提取，用逆转录酶将mRNA 逆转录为互补DNA（cDNA）。引物序列：NeuN 正向引物：5'CACGGCATGACCCTCTACAC 3'，反向引物：5'GTCTGTGCTGCTTCATCTGC 3'；β 肌动蛋白（β-actin）正向引物：5'GTCGTACCACTGGCATTGTG 3'，反向引物：5'TCTCAGCTGTGGTGGTGAAG 3'；VEGF 正 向 引物：5'TGCCCCTAATGCGGTGT3'，反 向 引 物：5'TGCTGGCTTTGGTGAGGTT3'。反应条件：预热94 ℃20 s，预热72 ℃30 s，共40 个循环。通过2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达水平。

1.10 统计学方法采用SPSS 20.0 软件进行统计。计量数据符合正态分布以± s形式表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，多组间的两两比较采用SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 各组大鼠海马组织病理学变化比较假手术组大鼠脑组织未见结构异常。CSVD 组大鼠脑组织结果紊乱，海马区齿状回病灶严重，神经组织大量坏死，脑皮质神经元变小，尼氏小体大量消失；干预后的G-CSF 组大鼠海马区较SCVD 组大鼠有明显改善，神经组织坏死数量减少。见图1。

2.2 各组大鼠神经元细胞凋亡率比较假手术组、CSVD 组、G-CSF 组 细 胞 凋 亡 率 分 别 为（21.34±4.43）%、（50.31±2.92）%、（30.90±8.10）%（F=69.72，P＜0.001）。与假手术组相比，CSVD 组增多（P＜0.05），G-CSF组明显低于CSVD组（P＜0.05）。见图2。

2.3 额皮质区微血管内皮细胞形态学变化假手术组微血管没有明显异常；CSVD 组可见血管管周结构溶解，血管内壁粗糙，血管基膜和基质之间的间隙增宽，细胞核大量固缩，线粒体内空泡严重；和CSVD组相比，G-CSF组大鼠脑组织微血管得到了明显改善，管周完整程度较CSVD 组也改善明显，内皮细胞核核固缩现象也明显减轻。见图3。

图3 各组大鼠微血管内皮细胞形态情况（透射电镜×12 000）：A为假手术组；B为脑小血管病（CSVD）组；C为粒细胞集落刺激因子（G-CSF）组

2.4 各组NeuN 阳性表达比较假手术组、CSVD组、G-CSF 组海马组织中NeuN 阳性细胞率分别为（0.572±0.015）%、（0.375±0.020）%、（0.551±0.012）%（F=456.60，P＜0.001）。与假手术组相比较，CSVD组明显降低（P＜0.05）；G-CSF 组明显高于CSVD 组（P＜0.05）。见图4。

图4 各组大鼠海马齿状回神经元核抗原（NeuN）表达情况（免疫荧光染色×200）

2.5 各组大鼠NeuN 和VEGF mRNA 表达水平比较与假手术组相比，CSVD 组大鼠海马齿状回NeuN 和VEGF mRNA 表达降低（P＜0.05）；与CSVD组相比，干预后的G-CSF 组大鼠NeuN 和VEGF mRNA表明显升高（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠NeuN和VEGF mRNA表达水平比较/± s

表1 各组大鼠NeuN和VEGF mRNA表达水平比较/± s

注：NeuN为神经元核抗原，VEGF为血管内皮生长因子。①与假手术组相比，P＜0.05。②与CSVD组相比，P＜0.05。

组别假手术组CSVD组G-CSF组F值P值鼠数10 10 10 NeuN mRNA 0.48±0.13 0.11±0.04①0.32±0.11①②33.76＜0.001 VEGF mRNA 1.45±0.21 0.76±0.31①1.31±0.26①②19.21＜0.001

3 讨论

CSVD 主要累及直径为30～800 μm 没有侧肢吻合的解剖终末动脉，包括颅内小动脉、微动脉、小静脉和毛细血管等，占全部缺血性脑卒中病因的25%～30%，有供血区域主要在脑深部白质及脑干，80 岁以上的老年人脑白质信号基本都高，其中脑微出血发病率占36%以上［9］。CSVD的发病相对隐蔽，在临床上以缺血性/出血性卒中、认知功能障碍等症状为主，但其具体的发病机制目前还不是十分的明确，因此对CSVD 的早期预防和治疗是未来临床研究的主要方向，也能为临床治疗提供可靠依据。有研究发现，CSVD 发病率主要集中于老年人，其发生发展极有可能有外周血内皮细胞的参与［10］。文献研究显示，脑小血管内皮损伤介导CSVD 的发病，CSVD 的早期病理生理变化很可能是脑小血管内皮损伤［11］。因此，促进脑小血管内皮细胞修复新生以减轻脑血管损伤可能是治疗CSVD的途径之一。

G-CSF 是一种刺激髓系造血细胞增殖、分化的生长因子，在临床上广泛应用，主要常用于中性粒细胞减少症［12］。研究证实，G-CSF 会透过血-脑屏障和其受体相结合而发生系列作用，例如动员造血干细胞、抗细胞凋亡、抗炎等［13］。近年来发现国内外已经应用G-CSF 治疗多种神经损伤性疾病，目前已经进入Ⅰ、Ⅱ期临床试验阶段；另外，G-CSF 在多种缺氧缺血性脑损伤新生动物模型中被证明在神经保护方面拥有巨大前景［14］。本研究采用同种系微栓子体外注入法制备CSVD 大鼠模型，造模成功后CSVD 组大鼠海马组织发生病理性改变，且大鼠的神经元细胞也出现了大量的凋亡，经过G-CSF 干预后的G-CSF 组和CSVD 组相比，大鼠海马组织得到明显改善，神经元细胞凋亡也得到了明显抑制，可见G-CSF 可有效改善CSVD 大鼠海马组织的病理学改变及抑制神经元细胞的凋亡。肖云月等［15］研究发现，G-CSF 可能通过增加VEGF 表达水平，促进脑小血管内皮细胞修复，减少神经元凋亡，从而减轻原发性高血压大鼠CSVD损伤。

临床研究发现，G-CSF可激活血管内皮细胞，动员内皮祖细胞，对血管的新生进行促进，改善大脑中动脉闭塞；其还会和神经元和神经胶质细胞上的相应受体结合，刺激细胞内信号转导通路促进神经发生，进而对神经进行保护［16］。本研究发现，CSVD组大鼠微血管损伤严重，给予G-CSF 后血管内皮损伤和血管周围水肿明显减轻，进而证实了G-CSF 对血管内皮能进行有效地保护。何晓英等［17］通过动物实验研究发现，G-CSF 可上调ICH 后VEGF 表达，增加血肿周围新生血管生成，改善神经功能。NeuN是一种可溶性核蛋白，在体外能与DNA 结合，识别神经元特异的核蛋白单克隆抗体的产生，已成为中枢神经系统成熟神经元的常用标志物，在大鼠大部分神经元有明显的表达［18］。VEGF 是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，可促进血管内皮细胞迁移、增殖及血管形成。本研究发现CSVD 组大鼠中NeuN 和VEGF mRNA 表达降低，G-CSF 干预后大鼠的NeuN 和VEGF mRNA 表达得到了明显回升，进而猜测G-CSF 通过提高NeuN 和VEGF 表达发挥神经保护作用。有研究证实，G-CSF 能增强脑组织中VEGF表达，从而发挥脑组织的保护作用［19］。

综上所述，G-CSF可促进内皮细胞增生修复、促进神经元存活而减少凋亡发生，同时有效促进NeuN的阳性表达，进而发挥脑保护作用。

（本文图1，2，4见插图9-3）